论文部分内容阅读
目的:本研究旨在通过构建体外BV-2细胞炎症模型,探讨miR-199a-5p对SIRT1的生物学调控功能,初步阐释在体外BV-2细胞炎症模型中miR-199a-5p调节炎性损伤的分子机制,为脑出血后继发性炎性损伤的干预治疗提供新的理论依据。方法:1.体外BV-2细胞炎症模型建立及验证、检测模型中miR-199a-5p及SIRT1的表达情况、SIRT1的亚细胞定位:利用CCK-8实验检测细胞的活力,qRT-PCR法、ELISA法及Western Blot法测定miR-199a-5p、SIRT1及促炎因子(IL-1β、IL-6)的相对表达量,免疫荧光染色显示SIRT1在BV-2细胞中亚细胞定位。2.验证miR-199a-5p与SIRT1的结合位点及调控关系:使用TargetScan、miRTarBase等生物信息软件预测miR-199a-5p与SIRT1的结合位点,并利用双荧光素酶报告基因实验验证;使用生物合成的miR-199a-5p mimic/inhibitor及阴性对照分别处理BV-2细胞,qRT-PCR法、Western Blot法测定miR-199a-5p、SIRT1的相对表达量。3.miR-199a-5p在BV-2细胞炎症模型中的机制研究:运用CCK-8实验测定细胞的活力,qRT-PCR法、ELISA法和Western Blot法测定SIRT1、NLRP3、Cleaved-Caspase1、ASC及促炎因子(IL-1β、IL-6)的相对表达量。结果:1.脂多糖(LPS)刺激BV-2细胞,BV-2细胞形态发生变化,BV-2细胞活性较对照组显著降低(P<0.05),促炎因子IL-1β和IL-6的表达较对照组明显增加(P<0.05)。2.在BV-2细胞炎症模型中,miR-199a-5p的表达较对照组显著上调(P<0.05);SIRT1 mRNA及蛋白表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。3.利用miR-199a-5p mimic/inhibitor及阴性对照分别转染处理BV-2细胞,miR-199a-5p在miR-199a-5p mimic组的相对表达明显高于mimic NC组(P<0.05),在miR-199a-5p inhibitor组的表达水平明显低于inhibitor NC组(P<0.05);在BV-2细胞炎症模型中,LPS+miR-199a-5p mimic组与LPS+mimic NC组相比,细胞活性明显下降(P<0.05),促炎因子IL-1β和IL-6的相对表达量明显增加(P<0.05),培养上清液IL-1β和IL-6的浓度显著增加(P<0.05);LPS+miR-199a-5p inhibitor组与LPS+inhibitor NC组相比,细胞活性明显升高(P<0.05),促炎因子IL-1β和IL-6的表达水平显著降低(P<0.05),培养上清液中IL-1β和IL-6的浓度显著降低(P<0.05)。4.细胞免疫荧光染色显示SIRT1主要表达在BV-2细胞的细胞核内。5.双荧光素酶试验结果显示,共转野生型报告基因的荧光强度较共转突变型报告基因的荧光强度明显降低(P<0.05)。miR-199a-5p mimic/inhibitor及阴性对照分别转染BV-2细胞,miR-199a-5p mimic组与mimic NC组相比,SIRT1 mRNA及蛋白表达量明显降低(P<0.05);miR-199a-5p inhibitor组与inhibitor NC组相比,SIRT1 mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.05)。6.在BV-2细胞炎症模型中,通过下调miR-199a-5p表达,同时抑制SIRT1,LPS+miR-199a-5p inhibitor+EX527组与LPS+miR-199a-5p inhibitor组比较:细胞活力明显减弱(P<0.05),促炎因子IL-1β、IL-6的相对表达量明显升高(P<0.05),上清液IL-1β、IL-6的浓度明显增加(P<0.05)。7.利用miR-199a-5p mimic/miR-199a-5p inhibitor及mimic NC/inhibitor NC分别转染BV-2细胞,再构建BV-2细胞炎症模型,LPS组与Control组比较,SIRT1的蛋白表达水平显著降低(P<0.05),NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase1的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);LPS+miR-199a-5p mimic组与LPS+mimic NC组相比,SIRT1的蛋白表达水平显著降低(P<0.05),NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase1的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);LPS+miR-199a-5p inhibitor组与LPS+inhibitor NC组相比,SIRT1的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase1的蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:在BV-2细胞炎症模型中,miR-199a-5p可以靶向结合SIRT1,并抑制SIRT1的表达,从而激活NLRP3炎症小体,进一步加重了LPS诱导BV-2细胞的炎性损伤。