差异显示法分离黑腹果蝇体色图式相关基因

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黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)作为遗传学研究的经典模式生物,其新突变体不断被发现、记录和研究。在黑腹果蝇突变体中包括很多体色表型发生变化的品系,近年来国内外在该领域的探索日益加快。本实验室黑腹果蝇的自发突变品系黑条体(blackstreak,BSR)体色呈现复杂的性状,由原来的背甲黑色(比已知黑檀体突变型略浅)分化为深黑、褐色和浅黄色。各体色品系虽然历经十余代的纯化,后代中除了出现深黑外,仍然有褐色和浅黄色的出现。 为了探讨出现该复杂性状的分子机制,本研究采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术比较黑条体突变体(BSR)与野生型黑腹果蝇(wildtype,WT)的基因差异表达,共得到6个差异表达片段。经RT-PCR验证,发现一长为215bp的阳性片段RTCY04在黑条体突变体(BSR)中的表达水平明显低于在野生型黑腹果蝇(WT)中的表达。将获得的RTCY04片段采用单引物PCR扩增技术,设计了三对引物进行PCR扩增,逐段测序,将重叠序列拼接。分别得到了844bp的WTRTCY04片段,804bp的BSRRTCY04片段,后者比前者缺失了40bp。通过Blastn检索发现,以上拼接序列的部分序列与一未知功能的基因CG31007的序列重叠,而BSR中缺失的40bp片段位于基因CG31007mRNA3’端。 由于RTCY04片段的序列与未知功能基因CG31007重叠,因此通过对基因CG31007的功能进行预测,可以初步分析阳性差异RTCY04片段的功能。本研究采用生物信息学工具搜索到基因CG31007的蛋白质序列中具有一个典型的一CHCH结构域([coiledcoil1]-[helix1]-[coiledcoil2]-[helix2]domain),预测与细胞色素C氧化酶的功能有关,基因命名为COX-R。另外还具有以下基序:3个蛋白激酶C磷酸化位点,2个cAMP-蛋白激酶磷酸化位点,3个酪蛋白激酶2磷酸化位点,5个N-端酰基化位点,1个天冬酰胺糖基化位点。其中,酪蛋白激酶2磷酸化位点与基因的转录表达或调控有关,糖基化、酰基化和磷酸化与蛋白质合成后的修饰与加工有关。 由此推测:阳性差异基因COX-R在BSRmRNA低水平表达以及3’端的缺失,影响了对应蛋白质(细胞色素C氧化酶功能相关)的表达,这可能间接影响了儿茶酚胺代谢,导致色素代谢的差异,从而使两者出现了明显差异的色素图式。关于果蝇体色图式与基因COX-R之间的关系还需要进一步的研究。
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