【摘 要】
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目的:肝纤维化与终末期肝病的发生发展密切相关,但目前尚无可靠的缓解肝纤维化的方法。肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）毛细血管化可诱导肝窦病理性血管增生,促进肝组织炎症和胶原沉积,是早期肝纤维化的特征性改变,也是治疗肝纤维化的重要靶点。我们前期研究发现,来源于人脐带的间质干细胞外泌体（mesenchymal stem cell deriv
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目的:肝纤维化与终末期肝病的发生发展密切相关,但目前尚无可靠的缓解肝纤维化的方法。肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）毛细血管化可诱导肝窦病理性血管增生,促进肝组织炎症和胶原沉积,是早期肝纤维化的特征性改变,也是治疗肝纤维化的重要靶点。我们前期研究发现,来源于人脐带的间质干细胞外泌体（mesenchymal stem cell derived exosomes,MSC-ex）能有效抑制肝纤维化、恢复肝功能,但具体机制尚不清楚。本课题旨在探讨MSC-ex抑制LSEC毛细血管化的作用和机制,为MSC-ex修复肝纤维化提供新的靶点和依据。方法:（1）贴壁培养MSCs,超速离心法提取上清液中的MSC-ex,纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）、透射电镜（transmission electron microscope,TEM）观察MSC-ex的形态结构,Western blot和成像流式分析MSC-ex标志性蛋白CD63、TSG101、Alix和CD9表达;（2）采用外泌体摄取试验检测LSEC内吞外泌体情况,采用肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导LSEC毛细血管化,并加入MSC-ex共培养,q RT-PCR和Western blot检测LSEC毛细血管化指标水平,小管形成试验检测LSEC管形成的能力。（3）构建蛋氨酸、胆碱缺乏饮食（methionine and choline diet,MCD）诱导的小鼠早期肝纤维化模型,尾静脉注射MSC-ex,通过免疫组织化学染色、天狼猩红染色、透射电镜、扫描电镜等评估MSC-ex对肝窦毛细血管化的抑制作用;（4）检测MSC-ex中泛素特异性肽酶9X（USP9X）表达,在LSEC中过表达及敲减USP9X,并通过Western blot、q RT-PCR、细胞免疫荧光等观察USP9X的抗LSEC毛细血管化作用及其可能调控的信号通路;（5）采用重组慢病毒转染构建敲减USP9X的MSC-ex(MSC-exsh USP9X),观察USP9X在MSC-ex抑制LSEC毛细血管化中的作用。结果:（1）MSC-ex表达外泌体标志性蛋白CD9、CD63、Alix和TSG101。透射电镜显示,外泌体为直径100～150 nm的圆盘状囊泡,具有外泌体的典型特征。（2）MSC-ex能够呈浓度依赖性减轻LSEC体外管形成能力,抑制血管化特异基因的表达。（3）MSC-ex能够减轻MCD饮食诱导的早期肝纤维化小鼠肝组织的胶原沉积及血管化指标Ang-2、CD34的表达,减轻肝组织炎症,缓解LSEC“失窗孔”现象。（4）USP9X过表达能够抑制LSEC的血管化特异基因Ang-2、CD34表达和体外管形成,而LSEC敲减USP9X则相反。（5）USP9X敲减(MSC-exsh USP9X)削弱MSC-ex对LSEC毛细血管化的抑制作用。结论:MSC-ex可能通过转运USP9X抑制LSEC介导的毛细血管化,缓解肝纤维化,有望成为一种抗肝窦毛细血管化的潜在治疗方案,应用于肝纤维化治疗。
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