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抗菌肽是各物种用来抵御细菌和外来病原体的内源性分子,是先天免疫系统的一部分。有较多的研究发现部分抗菌肽具有抗肿瘤活性,同时副作用较少。其中有研究基于牛乳铁蛋白,开发出一系列阳离子肽,主要由九种氨基酸组成,发现该系列多肽对肿瘤细胞具有很强的破坏作用,而对正常细胞的毒性较低,表现出较高的选择性。其中最有效的LTX-315在治疗实体瘤方面有一定疗效,但给药方式仅限于瘤内给药,应用受到了明显的限制。因此本研究基于阳离子九肽（KKWW）2K-NH2（AMP）,针对肿瘤微环境的高活性氧（ROS）和肿瘤细胞表面过表达的唾液酸基团,设计并构建出多功能抗肿瘤多肽,通过分子动力学模拟技术、体外细胞实验及荷瘤小鼠实验等验证其肿瘤靶向能力和抗肿瘤活性。本文主要分为如下四个部分:1.综述本章首先对抗菌肽的研究进行了总结,基于抗菌肽的构效关系分析了其抗肿瘤的作用机制,以及抗菌肽对肿瘤细胞的抗增殖、促凋亡和抗转移应用;其次围绕靶向递送的研究,分析了靶向治疗的生物屏障,并且对小分子药物、多肽、抗体和基于细胞的靶向策略进行了综述;最后介绍分子动力学模拟研究现状。这几方面的综述从而为本课题提供了理论基础和技术支撑。2.多功能抗肿瘤多肽的设计及构建本章旨在设计并构建多功能抗肿瘤多肽,在能够靶向肿瘤部位的同时发挥其抗肿瘤活性。有研究表明基于牛乳铁蛋白的阳离子抗菌肽,多肽序列中主要含有五个阳离子残基、2-3个色氨酸残基和1-2个侧链空间位阻偏大的非天然残基,这些阳离子抗菌肽对多种癌细胞具有明显的疗效,并且对正常细胞毒性较低。虽然在治疗实体瘤方面显示出临床前景,但仅限于瘤内给药,应用受到一定的限制。因此,本课题基于牛乳铁蛋白,提取出阳离子九肽序列（KKWW）2K-NH2（AMP）为模板,引入半胱氨酸残基（C）改造成适合修饰的多肽（KKWC）2K-NH2（Cys-AMP）;随后在Cys-AMP的半胱氨酸侧链巯基上修饰4-乙烯基苯基硼酸,从而构建抗肿瘤多肽（PBN-AMP）,具有肿瘤微环境刺激响应的能力以及与肿瘤细胞表面高表达的唾液酸特异性结合的能力。通过分子动力学模拟技术,研究设计的多肽在肿瘤微环境条件下与肿瘤细胞膜的结合情况。分别模拟了AMP、Cys-AMP和PBN-AMP的动力学行为,实验表明AMP与肿瘤细胞膜有一定的亲和力,但是结合的稳定性偏差,大约有10 ns的时间会游离出细胞膜,效果不理想。Cys-AMP在动力学模拟中发现与肿瘤细胞膜具有一定的结合能力,相比AMP要稳定一些。与前面两条多肽相比,在引入4-乙烯基苯基硼酸后,多肽PBN-AMP能够在较短时间内结合到肿瘤细胞膜上,并具有较高的稳定性,表明PBN-AMP与肿瘤细胞膜的亲和力更强,具有潜在更强的对肿瘤细胞的杀伤能力。采用多肽固相合成方法分别合成了多肽AMP和Cys-AMP。随后利用巯基-烯（Thiol-Ene）点击化学反应,将化合物4-乙烯基苯基硼酸修饰到多肽Cys-AMP上,合成多肽PBN-AMP;通过反相高效液相色谱（HPLC）和LC-MS对合成产物进行鉴定。3.多功能抗肿瘤多肽的体外活性研究本章通过细胞摄入实验及细胞毒性实验考察PBN-AMP的抗肿瘤活性,并且验证分子动力学模拟的结果。首先研究肿瘤细胞对多肽的摄取情况。利用FITC分别标记多肽AMP和PBN-AMP,制备得到多肽AMP-FITC和PBN-AMP-FITC,然后通过荧光显微镜观察人乳腺癌细胞MCF-7对两种多肽的摄取。实验结果表明,相比AMP,MCF-7细胞对PBN-AMP摄取量更多。随后考察三条多肽AMP、Cys-AMP和PBN-AMP的细胞毒性作用。分别培养人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231及鼠乳腺癌细胞4T1,用于多肽的细胞毒性考察。实验结果表明三条多肽在多种细胞系上均表现出不同程度的杀伤作用。三条多肽对MCF-7细胞的毒性作用最明显,其中PBN-AMP效果最好(IC50:38.46μM),Cys-AMP次之(IC50:39.85μM),AMP最差(IC50:110μM)。细胞毒性实验的数据能够验证分子动力学模拟的结果,表明使用分子动力学模拟技术验证多肽的肿瘤靶向性是可行的,具有较强的与肿瘤细胞膜结合能力的PBN-AMP表现出良好的抗肿瘤活性。4.多功能抗肿瘤多肽的体内活性研究通过构建4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型,进一步考察PBN-AMP的肿瘤靶向能力及抗肿瘤活性。小动物活体成像结果表明,和AMP相比,PBN-AMP能够更好地靶向聚集到肿瘤部位。药效学实验结果表明,PBN-AMP高剂量组（20 mg/kg）的小鼠肿瘤体重显著小于生理盐水组,其抑瘤率为59.36%。并且比较不同剂量组的抑瘤率能够发现:PBN-AMP的抗肿瘤作用具有剂量依赖性;并与多肽AMP相比,PBN-AMP具有更强的抗肿瘤活性。荷瘤小鼠实验的结果证明构建的PBN-AMP能够赋予多肽的肿瘤靶向性,并增强其抗肿瘤活性。综上所述,本课题设计并构建的多功能抗肿瘤多肽PBN-AMP,通过响应肿瘤微环境的刺激条件,表现出良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤活性,从而实现了靶向肽和治疗肽的融合,具有潜在的应用发展前景。并且本课题中使用分子动力学技术也为多肽的设计提供了一种可靠的验证手段,从而高效、低耗地优化生物活性大分子的设计。