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目的：筛选FGF21的最佳PEG定点化学修饰条件及最佳分离纯化条件，对修饰产物的活性、抗胰蛋白酶稳定性、抗热稳定性等生物性能进行评价。
方法：根掘影响PEG修饰的5个主要参数，即修饰反应缓冲液的pH值、FGF21与PEG的摩尔质量比、反应温度和反应时间、FGF21浓度等，设计一系列试验，选择最优的条件组合；在修饰的基础上，寻找一种有效的分离方法，对修饰混合物进行分离，以期得到高纯度的PEG-FGF21。根据修饰前后两者的分子量的差异：FGF21为19.5kDa，而PEG-FGF21则为40kDa左右，我们尝试了G-50、S-100等分子筛层析法。在使用分子筛层析法无法进行分离之后，我们又尝试了QFF强阴离子交换法，并且对主要的影响因素如缓冲液的pH、离子强度，洗脱液的pH、离子强度等进行了一系列的考察，最终得到了一个优化条件；通过MALDI-TOF质谱来检测是否只有一个PEG分子修饰到蛋白质表明；通过N-端测序来确定FGF21的N-末端是否被PEG所占据，并结合MALDI-TOF质谱的结果来判断在弱酸性条件下，PEG-丁醛是否单一、定点修饰到FGF21的表明；用CD检测PEG修饰对FGF21的二、三级结构有无影响；在此基础上根据FGF21能够刺激3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的吸收原理，先将3T3-L1前脂肪细胞经过15天的诱导分化成3T3-L1脂肪细胞，再分别给予等量的FGF21与PEG-FGF21，根据其摄糖率来评估FGF21与PEG-FGF21的活性；用2mM的胰蛋白酶于37℃水解FGF21和PEG-FGF21，分时取样，SDS-PAGE电泳，并根据条带灰度来计算水解率；用大鼠血清分别溶解FGF21和PEG-FGF21，于37℃保温，分时取样，并用葡萄糖氧化酶-过氧化酶(POD-GOD)法检测3T3-L1脂肪细胞吸收培养基中的葡萄糖，计算细胞摄取葡萄糖量，并分别跟未经加热处理过的PEG-FGF21、FGF21相比，取比值作图以考察PEG修饰对FGF21热稳定性的影响；采用ELISA法测定了修饰前后FGF21体内半衰期变化情况。
结果：根据对影响PEG修饰的5个主要参数，即修饰反应缓冲液的pH值、FGF21与PEG的摩尔质量比、反应温度和反应时间、FGF21浓度等条件的考察，得出PEG修饰的最佳条件是：pH为6.0的20mM的PBS缓冲液，FGF21与PEG的质量比为1：4，FGF21浓度为1mg/ml，4℃下反应8h者为最佳。通过分子排阻试验、强阴离子交换试验，得出的结论是：分子排阻层析法（G-50、S-100等）无法分离纯化得到纯度较高的PEG-FGF21，而离子交换(QFF)能够分离出纯度较高的PEG-FGF21，最优分离条件是：上样平衡液为0.1M，pH8.5的Tris缓冲液，洗脱液为80mM的NaCl，pH8.5;MALDI-TOF质谱的结果表明PEGFGF21的分子量为41.3kDa，提示只有一个PEG分子修饰到FGF21表面；N-端测序结果为FGF21的前五个氨基酸为：HPIPD而PEG-FGF21的前五个循环结果都是阴性，则表明PEG特异性修饰到FGF21的N-端α-氨基；CD结果显示PEG-FGF21与FGF21紫外吸收的趋势相同则表明PEG修饰过程对FGF21的空间结构基本上无影响。活性数据显示，本研究采用的PEG修饰方法对FGF21的生物学活性无显著影响；经过PEG修饰后的FGF21无论是血清稳定性还是抗胰蛋白酶水解能力均得到了较大程度的提高；另外，体内半衰期结果表明，FGF21经过PEG修饰后体内半衰期提高了将近6倍。
结论：本研究获得了一种稳定高效的FGF21定点PEG修饰工艺，并建立了修饰产物的纯化工艺，修饰产物不仅很好保留了蛋白质的生物学活性而且其热稳定性、抗胰蛋白酶水解能力显著提高、体内半衰期显著延长，从而为指导开发应用价值更大的FGF21类药物提供了理论支撑和技术思路。