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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种因感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引发的以妊娠母猪流产、仔猪呼吸系统损害和免疫抑制为特征的传染性疾病,在我国被列为二类传染病。PRRS是影响全球养猪业的重要疾病之一,目前仍在全球猪群中广泛存在。针对该病主要采取的防治措施是预防为主,目前市场主要疫苗为灭活苗和减毒活疫苗,但这两种疫苗在有效性和安全性方面存在着一些难以克服的缺点。截止目前,尚未有针对该病的特效治疗药物。本实验室在前期研究中获得了一株由杆状病毒表达的PRRSV-GP3蛋白免疫小鼠制备的单克隆杂交瘤细胞株,克隆号为“Mab-PN9cx3”,通过体外试验发现,Mab-PN9cx3具有广谱反应性,且对不同PRRSV具有中和活性,本研究拟制备该单克隆抗体,通过体外细胞试验确认其反应性和中和活性,并通过PRRSV感染仔猪后单克隆抗体治疗效果评价试验,确定其对异源PRRSV毒株的保护效果,为后续开发PRRS防治手段提供支持。本研究的工作内容和结果如下:1.Mab-PN9cx3单克隆抗体的制备以及反应性和中和活性的确认将分泌Mab-PN9cx3单克隆抗体的杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔并收集腹水,用硫酸铵沉淀法粗提蛋白,后经Protein G Resin层析纯化获得高纯度单克隆抗体Mab-PN9cx3。经IFA试验证明被PRRSV-1和PRRSV-2型毒株所感染Marc-145细胞均可被该单克隆抗体识别,证实了该单克隆抗体对PRRSV具有广谱反应性。随后对不同浓度Mab-PN9cx3单克隆抗体与PRRSV-1和PRRSV-2型病毒作用后的细胞裂解物,经Western Blot和qPCR检测PRRSV N蛋白表达水平和转录水平,结果显示该单克隆抗体可明显抑制PRRSV在细胞内的增殖;病毒滴度测定结果显示加入该单抗后病毒滴度明显下降,随着单抗浓度的加大,对应的病毒滴度呈梯度下降,说明该单克隆抗体在体外试验上对PRRSV具有广谱中和活性。2.Mab-PN9cx3单克隆抗体在仔猪上对异源PRRSV感染的保护效果评价28～35日龄健康仔猪28头,分为7组,每组4头。各组按照试验分组和攻毒治疗方案中治疗药物种类分别给药,给药后分别攻击JXA1（GenBank Accession no.EF112445.1）（105TCID50/mL）或 NADC30 样毒株 HNhx（GenBank Accession no.KX766379）（105TCID50/mL）或PBS。攻毒后观察仔猪临床症状、体温、剖解后各脏器病变情况,进行肺部病变计分和肺部显微病理组织切片以及肺门淋巴结免疫荧光检测,判定该单抗在体内对异源PRRSV感染的保护效果。结果显示,单抗治疗组的临床症状明显减轻,体温在攻毒前后变化较小,而非治疗攻毒组稽留热症状明显;同时单抗治疗组剖解后肺部和淋巴组织未见明显病变,肺部显微病理组织切片仅观察到轻微病理损伤,而非治疗攻毒组和同型抗体对照组肺部有明显肉变或实变,且显微病理组织切片可清晰见到典型的间质性肺炎病变;肺门淋巴结进行免疫荧光检测显示,该单抗治疗后可明显减少仔猪淋巴组织中PRRSV抗原含量,且对不同基因型PRRSV病毒均有明显抑制作用。说明该单抗在仔猪上对异源PRRSV感染保护效果明显。3.Mab-PN9cx3在仔猪上对异源PRRSV感染的保护机制本研究对感染仔猪体内PAMs细胞进行病毒载量测定以及转录组分析,以确定Mab-PN9cx3单克隆抗体作用路径以及因逆转PRRSV感染所发生改变的基因。结果显示,单克隆抗体治疗组在攻毒后21d猪PAMs细胞中病毒载量明显低于非治疗组,这与抗体治疗后显著的降低了动物临床症状、肺部和淋巴组织的病理损伤和显微病变相一致,显示这是该单抗保护PRRSV攻击的一个重要指标。但该单抗治疗后对机体病毒血症改善没有明显效果。转录组分析发现表达谱发生逆转的基因很少与促炎细胞因子相关,但发现感染病毒后类固醇激素反应通路相关的基因表达上调经单抗治疗后上调基因表达发生逆转,恢复到健康组蛋白表达水平。PAMs转录组进一步分析发现,在感染PRRSV后有大量与M1活化相关细胞因子如IL-12、iNOS、TNF-α、IL-1 β和IL-6等表达上调,同时检测到单抗治疗组猪血清中有大量粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）蛋白表达,推测可能是单抗治疗后促进机体pGM-CSF蛋白的大量表达,激活动物机体PAMs向着M1方向活化有关,进而加速细胞清除病毒能力,进一步激活免疫系统对抗PRRSV感染。