前言：　　 老年性痴呆在临床上主要表现为学习和记忆能力的下降,它主要包括两种最常见的疾病,即阿尔茨海默病和血管性痴呆。其中阿尔茨海默病发病率最高,主要的病理变化是脑内Aβ增多和神经缠结形成,而血管性痴呆主要是由于大脑的血管和血流异常而引发。　　 目前关于痴呆的确切机制还不清楚,大量的研究支持钙离子浓度的改变在阿尔茨海默病和血管性痴呆中起到了关键作用。电压依赖的钙离子通道在神经的生长以及突触重塑方面发挥了非常重要的作用,其中L-型钙离子通道(LTCC)在大脑中占80%,与神经的生长和死亡的关系最为密切。通过LTCC进入神经细胞的钙离子能够有效的激活CREB以及CREB介导的基因转录。　　 钙离子进入细胞内与钙调蛋白(Calmodulin,CaM)结合,而CaM对神经细胞的生长发育密切相关,钙离子与CaM形成的复合物Ca2+/CAM能够调节神经细胞的许多蛋白,其中包括钙调蛋白激酶Ⅱ、Cav1.2等。　　 钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一种钙离子激活的酶,这种酶在脑组织中的含量高达1-2%,它作为一个兴奋转录偶联的介导因子在学习和记忆功能方面作用很大。被复合物Ca2+/CAM激活后参与神经突触的重塑、学习记忆增强等。CaMKⅡ能够磷酸化Cav1.2α亚基或者与Cav1.2α亚基的-COOH结合引起钙离子依赖的易化作用。　　 脑源性神经生长因子(BDNF)在脑的发育、分化、突触重塑等方面发挥了重要作用,在阿尔茨海默病的早期就有BDNF含量下降,它的转录受到CREB的调节,所以CREB/BDNF信号通路参与调控大脑学习记忆功能。　　 多奈哌齐是胆碱酯酶抑制剂,临床上主要应用于阿尔茨海默病人,改善患者的学习记忆能力,还有文献报道多奈哌齐的预处理可以减少局灶性脑缺血的梗死面积,对谷氨酸的兴奋毒性也有保护作用。这些证据表明多奈哌齐对脑组织有保护作用,但是对全脑缺血引起的学习记忆能下降的改善作用未见报道,所以本实验对全脑缺血致沙鼠认知能力下降给予多奈哌齐进行治疗,并进一步探讨多奈哌齐的改善作用是否与CaMKⅡ/CREB信号通路相关。　　 本实验选用了国际公认的APP/PS1转基因小鼠做为阿尔茨海默病的研究模型,同时也在细胞水平进行了研究,选用的细胞模型为Aβ1-42诱导海马神经元损伤模型。血管性痴呆模型我们选用先天脑Willis环缺失的蒙古沙土鼠,利用双侧颈动脉暂短闭塞造成脑组织缺血,再用行为学检测学习记忆能力,学习记忆能力下降的即为血管性痴呆模型。到目前为止,在APP/PS1小鼠及Aβ1-42诱导海马神经元损伤模型与沙鼠血管性痴呆模型中Car1.2、CaM、CaMKⅡ、CREB和BDNF的表达变化以及分布变化未见系统的阐述,我们认为在这些模型中这几个蛋白参与了学习记忆的减退。所以本实验主要研究在这些模型中Cav1.2、CaM、CaMKⅡ、CREB和BDNF蛋白表达的变化以及其相互关系的变化。　　 实验材料和方法：　　 一、材料　　 动物、试剂与仪器:健康APP/PS1转基因小鼠和C5781/6小鼠,9月龄,每个实验组均为8只;Wistar新生鼠若干只,均为出生一天;蒙古沙土鼠,70-80g,雄性。均由中国医科大学实验动物部提供。鼠抗CaM(SantaCruz),鼠抗Car1.2(Abcam),兔抗CaMKⅡ(SantaCruz),兔抗p-CaMKⅡ(SantaCruz),兔抗p-CREB(Abcam),兔抗CREB(SAB),兔抗BDNF(santaCruz),β-actin(santaCruz);增强型化学发光液(Applygen);Nissl液(碧云天),HE染液(碧云天);Fluo-3/AM(日本同仁);胰酶(北京中杉),胎牛血清(四季青),Neurobasal(Gibco),B27(Gibco);多奈哌齐(同本卫材);CM1900UVLEICA冰冻切片机(德国),电泳仪(Bio-Rad),共聚焦显微镜(Nikon)。　　 二、方法　　 (一)原代神经细胞的体外培养　　 出生1天的乳鼠取出大脑,分离出海马组织,然后用0.125%的胰酶消化5-8分钟,加入15%胎牛血清终止消化,吹散细胞,将细胞种植在瓶皿中,第二天将细胞培养液换成含有2%B27的Neurobasal培养基,3-4天换液一次,培养到第9天进行实验。　　 (二)原代神经细胞MTT实验　　 将培养9天的神经细胞培养液换成无酚红的DMEM培养基,加入不同浓度的Aβ1-42(0,1,2,4,8,16μM),24小时后细胞用0.5mg/ml的MTT孵育4小时,再用150μLDMSO溶解结晶颗粒,在570nm波长下检测光密度值。　　 (三)神经细胞内钙的检测　　 培养9天的神经细胞用5μMFluo-3/AM与0.5%PluronicF-127在37℃孵育30分钟,然后用培养液洗去吸附在细胞外面的多余Fluo-3/AM,Aβ1-42组预先用Aβ1-42孵育24小时再加入Fluo-3/AM。用激光共聚焦显微镜进行观察结果,荧光的相对光密度值代表钙离子的浓度。　　 (四)沙鼠脑缺血模型的建立　　 用10%的水合氯醛麻醉沙鼠(350mg/kg),暴露双侧颈总动脉,用动脉夹同时将双侧颈总动脉夹闭,10分钟后打开,重新恢复血流,缝合皮肤,整个手术过程中沙鼠的体温保持在36-37℃,减少手术的死亡率。　　 (五)Morris水迷宫实验　　 这个实验是用来评价沙鼠学习记忆能力的实验,在缺血后21天进行实验。首先进行3天的适应性游泳实验,将沙鼠每次从第三象限放入直径120cm,高40厘米的水槽内,水温控制在20-22℃,让它去寻找放在第一象限的露出水面1.5cm的一个直径8cm的平台,第4天到第7天进行隐蔽平台实验,将平台低于水面1.5cm放置,让沙鼠寻找,如果60秒钟过后沙鼠还未能爬上平台,终止实验,将沙鼠放在平台上20秒,同时成绩记为60秒。每天实验3次。在第8天将平台移走进行空间探索实验,将沙鼠从第三象限放入,记录它在60秒钟内穿越平台所在位置的次数。　　 (六)Nissl染色与HE染色实验　　 沙鼠麻醉后,进行心脏灌流,然后将脑组织取出,放入4%多聚甲醛中固定24小时,再用30%的蔗糖沉糖4天,然后将脑组织切成6微米厚的脑片,用Nissl染液或HE染液染色,在光镜下观察结果。　　 (七)免疫印迹分析　　 APP/PS1组、缺血性痴呆组及对照组腹腔麻醉后快速取出鼠海马提取总蛋白。体外培养的海马神经细胞在第10天提取总蛋白。BCA法测蛋白浓度,上样后进行SDS-PAGE蛋白电泳,一抗(anti-CaM,1:400稀释;anti-Cav1.2,1:400稀释;anti-CaMKⅡ,1:400稀释;anti-p-CaMKⅡ,1:400稀释;anti-p-CREB,1:1000稀释;anti-CR:EB,1:500稀释;anti-BDNF,1:200稀释;β-actin,1:5000稀释)4℃孵育过夜,二抗1:5000稀释,室温孵育1小时,ECL显影。实验结果用QuantityOne软件分析。　　 (八)免疫荧光分析　　 APP/PS1组、缺血性痴呆组及对照组腹腔麻醉后快速取出鼠脑,常规制作冰冻切片。一抗(鼠抗Cav1.2,1:50稀释;兔抗p-CaMKⅡ,1:100稀释),4℃过夜,用FITC标记的羊抗鼠和Cy3标记的羊抗兔二抗孵育切片,DAPI染核,PBS漂洗三次后,激光共聚焦显微镜观察。　　 (九)多奈哌齐灌胃及分组　　 实验分为正常组、缺血痴呆组和多奈哌齐治疗组。缺血组的造模方法同上,造模后给予多耐哌齐灌胃(5mg/kg)21天,然后进行Morris水迷宫行为学实验,包括隐蔽平台实验和空间探索实验,对脑组织进行HE染色观察,检测p-CaMKII、CaMKⅡ、p-CREB和CREB蛋白表达情况。　　 (十)统计学分析　　 各组结果以平均数士标准差表示,两组间比较用t检验,多奈哌齐实验结果采用One-wayANOVA统计方法,p＜0.05作为差异显著性界值。　　 结果：　　 一、MTT结果　　 Aβ1-42对神经细胞的损伤呈剂量依赖性,在Aβ1-42的浓度在4μM时神经细胞的存活率显著下降(63.51±1.29%;p＜0.01)。　　 二、神经细胞内钙检测结果　　 Aβ1-42处理的神经细胞内钙离子浓度明显高于正常组(137.75±21.10vs.74.32士9.66;p＜0.01)。　　 三、Morris水迷宫结果　　 在平台搜索实验中两组的上台时间逐渐减少,正常组上台时间明显少于缺血组(41.47±4.50vs.43.1±3.50s,第一天,p＞0.05;33.38±3.25vs.48.54±3.49s,第二天,p＜0.05;27.05±2.96vs.46.60±3.14s,第三天,p＜0.01;24.23±2.59vs.47.37±3.04s,第四天,p＜0.01);在空间探索实验中正常组沙鼠的穿越次数明显多于缺血组(5.29±2.14to2.29±1.38;p＜0.01)。在多奈哌齐治疗脑缺血实验中,三组的潜伏期逐渐缩短,缺血组沙鼠的潜伏期显著高于正常组,多奈哌齐组的潜伏期高于缺血组(p＜0.05-0.01),缺血组的穿梭次数与正常组相比显著减少(2.25±1.04vs.5.13±1.56;p＜0.01),然而经过多奈哌齐治疗穿梭次数与缺血组相比显著增加(4.38±0.74vs.2.25±1.04;p＜0.01)。　　 四、脑组织切片染色结果　　 Nissl染色结果中海马的CA1区可以明显的观察到,缺血组的CA1区的锥体神经细胞缺失。HE染色中我们观察到正常组海马的结构清晰,锥体细胞排列整齐,模型组的锥体细胞数减少,尤其CA1区锥体细胞数减少,结构不清,多奈哌齐组锥体细胞数与模型组相比增加(86.67±7.79vs.43.50±3.62;p＜0.01)。　　 五、免疫印迹结果　　 在APP/PS1小鼠海马中,CaM蛋白的表达与正常组相比显著上调(1.22±0.18vs.0.46±0.10;p＜0.01);P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的比值下降(0.51±0.02vs.0.87±0.09;p＜0.01):Cav1.2蛋白表达减少(0.37±0.08vs.0.80±0.08;p＜0.01);p-CREB/CREB的比值变小(0.50±0.05vs.0.67±0.12;p＜0.05);BDNF的蛋白表达减少(0.78±0.15vs.1.26±0.17;p＜0.01)。在Aβ1-42致神经细胞损伤模型中,CaM蛋白的表达与正常组相比无显著变化(0.97±0.15vs.1.04±0.14;p＞0.05);p-CaMKⅡ/CaMKⅡ的比值下降(0.59±0.09vs.0.80±0.10;p＜0.05);Cav1.2蛋白表达增加(1.22±0.16vs.0.83±0.13;p＜0.01);p-CREB/CREB的比值变小(0.74±0.07vs.0.89±0.07:p＜0.05);BDNF的蛋白表达减少(1.17±0.20vs.2.03±0.26;p＜0.01)。在缺血性痴呆模型中,CaM蛋白的表达与正常组相比显著上调(1.38±0.17vs.0.60±0.23:p＜0.01);P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的比值下降(0.48±0.04vs.0.71±0.10;p＜0.01);Cav1.2蛋白表达增加(1.18±0.18vs.0.83±0.17;p＜0.05);p-CREB/CREB的比值变小(0.37±0.07vs.0.75±0.07;p＜0.01);BDNF的蛋白表达减少(0.85±0.14vs.1.17±0.17:p＜0.05)。在多奈哌齐治疗脑缺血实验中,模型组的p-CaMKⅡ/CaMKⅡ的比值与正常组相比下降到59.04±8%,p＜0.01:而多奈哌齐组的P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的比值与正常组相比上升到89.22±7%,p＜0.01:模型组的p-CREB/CREB的比值与正常组相比下降到40.56±12%,p＜0.01;而多奈哌齐组的P-CREB/CREB的比值与正常组相比上升到80.53±22%,p＜0.01。　　 六、免疫荧光结果　　 在APP/PS1小鼠海马图片中,我们观察到在海马CA1、CA3及DG区均有Cav1.2与p-CaMKⅡ共表达的阳性神经细胞,在海马的CA1区模型组Cav1.2与P-CaMKⅡ共表达的阳性神经细胞少于正常组的共表达阳性细胞数(55.30±9.25vs.86.45±9.00;p＜0.01),在海马的CA3区模型组Cav1.2与p-CaMKⅡ共表达的阳性神经细胞少于正常组的共表达阳性细胞数(51.15±8.76vs.81.17±11.58;p＜0.01),在海马的DG区模型组Cav1.2与p-CaMKⅡ共表达的阳性神经细胞无明显的改变(88.56±5.59vs.90.30±6.03;p＞0.05)。在脑缺血海马图片中,我们观察到在海马CA1、CA3及DG区均有Cav1.2与p-CaMKⅡ共表达的阳性神经细胞,在海马的CA1区模型组Cav1.2与p-CaMKⅡ共表达的阳性神经细胞少于正常组的共表达阳性细胞数(43.07±7.96vs.85.10±11.04;p＜0.01),在海马的CA3区模型组Cav1.2与p-CaMKⅡ共表达的阳性神经细胞少于正常组的共表达阳性细胞数(55.83±9.60vs.85.23±9.42;p＜0.01),在海马的DG区模型组Cav1.2与p-CaMKⅡ共表达的阳性神经细胞无明显的改变(78.40±8.57vs.87.85±10.91;p＞0.05)。　　 结论　　 1、本实验成功建立了血管性痴呆的动物模型和Aβ1-42诱导神经细胞损伤模型。　　 2、首次通过APP/PS1转基因小鼠阿尔茨海默病模型、Aβ1-42诱导神经细胞损伤模型与缺血性痴呆模型对海马组织Cav1.2、CaM、CaMKⅡ、CREB和BDNF5个蛋白进行研究,发现了Cav1.2在这三种模型中的表达不一致,CaM、CaMKⅡ、CREB和BDNF在三种模型中的表达一致。　　 3、首次证实,Cav1.2与p-CaMKⅡ在APP/PS1小鼠和缺血性痴呆沙鼠大脑海马组织中存在共定位,在CA1和CA3区的共定位表达的神经细胞数量与正常组相比显著减少,Cav1.2与p-CaMKⅡ共定位神经细胞的减少与学习记忆能力密切相关。　　 4、首次证实,多奈哌齐对沙鼠全脑缺血导致的痴呆有改善作用,其作用机制与CaMKⅡ/CREB信号通路相关。