论文部分内容阅读
研究背景Th细胞漂移是一种免疫抑制现象。在生理情况下,幼稚T辅助淋巴细胞CD4+Th0是双向分化的,在接受抗原激发后按一定比例向Th1和Th2细胞方向分化。Th1和Th2细胞彼此间相互调节、相互抑制,从而使两者处于相对平衡状态。在免疫应答的起始阶段,机体免疫免疫系统如果选择以某一亚群为主的应答,这种Th细胞就会正反馈地加强自身优势,抑制另一亚群分化,从而导致Th细胞漂移。术后Th2细胞漂移导致细胞免疫功能受损,增加术后感染的风险,并可能导致肿瘤患者手术术后肿瘤转移和复发。研究发现吗啡类阿片类药物使用与术后Th2细胞漂移有关。吗啡是经典的阿片受体激动剂,目前仍然是手术后急性疼痛治疗的首选。离体研究和动物实验均证实,吗啡可在发挥镇痛作用的同时,促进Th细胞向Th2漂移,外周μ受体拮抗剂能剂量依赖性地拮抗吗啡促Th2细胞漂移作用。鉴于吗啡诱导Th2细胞漂移及其对围术期免疫功能的影响,因此,深入探寻吗啡镇痛对Th2细胞漂移的机制,寻找有效抑制吗啡诱导的Th1/Th2失衡,对改善围术期患者的免疫功能具有重要意义。GATA3是Th2细胞分化关键转录因子。GATA3直接结合到IL-4、IL-13基因位点,通过表观遗传学修饰,促使这些基因位点向开放构象转化,促进Th2细胞细胞因子转录。高水平IL-4的产生和GATA3表达的自动激活构建了正反馈环,其进一步诱导GATA3的表达和Th2的分化。另外,GATA3能抑制Th细胞向Th1方向分化,使得Th1/Th2比例进一步降低。PKC-θ在T细胞中选择性地高表达,在T细胞活化、增殖和分化中起重要作用。PKC-θ敲除后Th2极化受损,伴随GATA3活性降低,说明PKC-θ激活是GATA3活化及Th2细胞漂移的上游事件。基于上述依据,我们推测吗啡通过激活T细胞表面μ受体,影响PKC-θ磷酸化,进而促进Th2细胞关键转录因子GATA3基因表达、活性增强(μ受体-PKC-θ-GATA3信号通路),诱导Th2细胞漂移。吗啡的这种作用可被μ受体拮抗剂和PKC-θ抑制剂所逆转。本课题首先使用不同浓度吗啡诱导幼稚CD4+T细胞分化,运用流式细胞,ELISA等技术观察T细胞分化情况、IL-4m RNA表达和生成、研究吗啡诱导分化过程中的量效关系;在第二部分研究中,使用吗啡、吗啡拮抗剂纳洛酮及PKC-θ拮抗剂AEB071诱导幼稚CD4+T细胞分化,通过Western Blot、RT-PCR、EMSA等技术检测PKC-θ磷酸化水平及GATA3表达和活性,探讨μ受体-PKC-θ-GATA3信号通路在Th2细胞漂移中的作用,阐明吗啡诱导Th2细胞漂移的分子机制。研究目的1.探讨吗啡诱导幼稚CD4+T细胞Th2漂移的量效关系;2.研究幼稚CD4+T细胞分化中μ受体-PKC-θ-GATA3信号通路的作用,阐明吗啡诱导Th2细胞漂移的分子机制,为调节术后Th细胞平衡寻找可能干预靶点。研究方法1.不同浓度吗啡预处理幼稚CD4+T细胞,IL-2和CD28刺激24小时后,流式细胞检测细胞分化,RT-PCR和ELISA检测IL-4和IFN-γ表达和浓度,探讨吗啡刺激的最佳浓度。2.Western blot检测PKC-θ磷酸化水平,RT-PCR检测IL-4、GATA3表达,ESMA检测GATA3活性,探讨μ受体激活/阻断在Th2细胞分化信号通路中的作用。3.Western blot检测PKC-θ磷酸化水平,RT-PCR检测IL-4、GATA3表达,ESMA检测GATA3活性,探讨PKC-θ激活/抑制在Th2细胞分化信号通路中的作用。研究结果1.PT-PCR检测培养24h后细胞裂解液中IL-4、IFN-γ的m RNA表达,结果发现吗啡50ng/ml处理组IL-4m RNA表达水平显著高于其他浓度组,IFN-γm RNA各组无差异;ELISA法检测细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ浓度,结果发现吗啡50ng/ml处理组IL-4浓度高于其他浓度组,IFN-γ浓度各组间无显著差异。流式检测显示Th2细胞分化比例在吗啡50ng/ml组最高。2.Western blot结果显示,吗啡处理组PKC-θT538和S676两个位点磷酸化水平较对照组显著增高,吗啡+纳络酮组较吗啡组PKC-θ磷酸化水平显著降低;RT-PCR结果显示吗啡处理组IL-4、GATA3的m RNA表达水平显著升高,而加入纳络酮处理后明显低于吗啡组;EMSA结果显示吗啡处理组GATA3活性增强,吗啡+纳洛酮处理组显著降低。单独应用纳洛酮与对照组无显著差异。3.AEB071处理后显著降低吗啡诱导IL-4、GATA3的m RNA表达水平,PKC-θ磷酸化水平及GATA3活性。单独使用AEB071组与对照组无显著差异。研究结论1.吗啡诱导幼稚CD4+T细胞向Th2漂移,当浓度在50ng/ml时,分化效能最高。2.吗啡诱导幼稚CD4+T细胞漂移过程中,PKC-θ磷酸化水平增高,GATA3表达和活性增强,这种效果能被吗啡拮抗剂纳络酮逆转。提示吗啡激活μ受体通过PKC-θ-GATA3信号通路诱导Th2细胞漂移。3.AEB071处理能抑制吗啡诱导的Th2漂移,PKC-θ磷酸化水平降低,GATA3表达和活性降低。提示吗啡诱导Th2漂移信号通路中PKC-θ的关键作用。