论文部分内容阅读
CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPRassociated）系统是原核生物所特有的一种后天免疫系统,广泛存在于古菌和细菌中,能够抵御质粒、病毒等外源遗传物质的入侵。每套CRISPR-Cas系统至少包括CRISPR簇和cas基因两个遗传单位。在最新的分类中,CRISPR-Cas系统被分为两大类,六种不同的主要类型。其中,只有Ⅲ型CRISPR-Cas系统既具有RNA切割活性又具有DNA切割活性,是目前已知的唯一具有双核酸干涉活性的CRISPR-Cas系统。之前研究表明,冰岛硫化叶菌REY15A菌株的Ⅲ-B型Cmr-α系统能够规律间隔6nt切割靶标ssRNA,且crRNA一旦与同源的靶标RNA结合,被激活的三元复合体（Cmr-α::target RNA）显示出很高的非特异性ssDNA切割活性。而Cmr-α系统的这种双核苷酸切割活性是如何被调控的,至今还有许多未知。本论文经研究认为,Cmr1α能够作为一个整合激活模块来增强Cmr-α系统的核酸干涉活性,而Cmr4α在Cmr-α系统免疫过程中复杂激活的时空调控中发挥重要作用。为了研究Cmr复合体的非必须亚基Cmr1的功能,本研究在冰岛硫化叶菌（S.islandicus REY15A）中首先构建了一个缺失突变株ΔβΔ1α。体内干涉活性分析表明,ΔβΔ1α缺失突变株仍然能够干涉靶标RNA和入侵质粒,但其活性都大大降低,但仍可以从ΔβΔ1α缺失株中纯化得到不含有Cmr1α的稳定核心核酸蛋白复合体Cmr-αΔ1（Cmr2α-6α）。体外生化分析发现,Cmr-αΔ1复合体中的crRNA发生大量降解,但是仍然具有微弱的切割ssRNA和ssDNA的活性,与体内的干涉活性相一致。经过保守氨基酸和蛋白结构模拟分析显示,Cmr1αN端的第一个α-螺旋上的氨基酸相当保守,并位于Cmr1α蛋白的表面凹槽内。分析部分保守氨基酸的体内体外数据表明,Cmr1α的两个保守疏水氨基酸（W58和F59）对体内的入侵质粒沉默活性和体外切割DNA的影响较大,主要负责Cmr1α与靶标RNA的结合;另外四个高度保守氨基酸（I52,G54,R57和R61）则对靶标RNA的体内干涉活性和体外切割活性影响更大,主要负责Cmr1α与crRNA的结合。Cmr1α虽然不是Cmr-α复合体所必须的,但是一旦与核心复合体结合,能够大大增强Cmr-α复合体依赖于crRNA与目标RNA结合的核酸干涉活性。此外,Cmr1的存在与微生物嗜热生活方式的相关性,也反映了Ⅲ型CRISPR-Cas系统的进化适应性。Cas10蛋白家族（Csm1和Cmr2）作为Ⅲ型CRISPR-Cas系统的特征蛋白,其两个保守结构域分别负责非特异性ssDNA切割和激活非特异性ssRNA切割的第二信使cOAs合成。该第二信使能够激活Csx1的CARF结构域而大量非特异性降解ssRNA。本研究数据表明,当靶标RNA表达不活跃时,Cmr2α的Palm2结构域起主要沉默作用;而当靶标RNA表达活跃时,Cmr2α的HD结构域的活性显著增强,也会致死宿主细胞。Cmr4作为Ⅲ-B型Cmr复合体的大亚基骨架蛋白,对于复合体的组装和稳定性非常重要。通过选取一些Cmr4同源蛋白进行多序列比对,本研究确定了一系列保守的功能氨基酸残基。通过体内活性分析,结果显示突变这些SisCmr4α保守氨基酸会严重影响Cmr-α系统的体内干涉活性。通过纯化来自突变体的效应复合物时,发现只有从Δβ4α-D83A和Δβ4α-H16A两个突变株中才能纯化得到稳定的Cmr-α复合体。这表明大多数cmr4α的突变可能会影响效应复合物的结构。此外,本研究得到的突变效应复合物中,只含有3个Cmr4α的小复合体的比例较高,而野生型Cmr-α效应复合物中含有4个Cmr4α的大复合体的比例较高,但突变复合体与野生型复合体在体外切割核酸的模式一致。为研究由Cmr4αD27A突变对细胞的致死,我们在Δβ4α-D83A突变株基础上成功突变D27A得到双突变株Δβ4α-D27/83A,却无法从双突变株中纯化得到完整的Cmr-α复合体。这说明D83A点突变很可能影响了Cmr-α复合体的稳定性,或者D27A突变加剧了复合体的不稳定性。Cmr2α的HD结构域和Palm2结构域均突变的菌株,既失活了DNase活性也失活了c-A4的合成活性,从而可以在该双突变株体内成功突变Cmr4αD27A。结合凝胶迁移阻滞结果分析可知,该突变株呈现出独特的Cmr-α复合体和靶标RNA结合模式。这一结果为进一步研究靶标RNA的结合、切割以及产物释放提供了重要的依据。Ⅲ型CRISPR-Cas系统被公认为是一个需要靶标RNA激活的免疫系统。它能够依赖于靶标RNA与crRNA的结合,激活非特异性ssDNA切割,并在切割靶标RNA并释放产物后,失活DNase活性。因此,Ⅲ型系统的核酸蛋白复合物切割非特异ssDNA的速度非常快,并通过切割靶标RNA而失活自身沉默活性来避免“自我免疫”。Cmr4αD27A突变后,Cmr-α突变复合体不能有效切割靶标ssRNA,复合体始终被激活而不断大量地切割非特异性ssDNA,对自身基因组造成不可逆损伤,从而导致宿主细胞死亡。综合以上结果表明,Cmr4α在Cmr-α免疫过程中对Cmr-a的核酸酶活性和环化酶活性的时空调控起着至关重要的作用。