研究目的:本课题组前期结果表明内源性信号气体分子H2S能够在LPS诱导的中枢神经炎症模型中通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)选择性诱导小胶质细胞从释放促炎症因子(M1)状态转向释放抗炎症(M2)因子状态,进而抑制神经炎症。但其上游具体机制仍有待考究。基于课题组前期研究结果,本课题利用多种H2S供体(包括无机和缓释H2S供体),探讨H2S脑缺血后激活AMPK诱导小胶质细胞M2的上游机制及H2S是否通过这一上游机制抑制脑缺血后神经炎症。研究方法:在细胞水平:1)利用线粒体复合物Ⅳ的活性检测探究H2S供体激活AMPK是否是通过抑制线粒体复合物Ⅳ的活性;2)利用能与H2S发生反应产生不溶物ZnS的ZnCl2,探索不同的H2S供体的作用是否是是释放的H2S所介导;3)通过测定细胞耗氧量(OCR)、利用荧光探针(JC-1和TMRM)测定线粒体膜电位等手段探讨H2S供体是否通过线粒体解偶联激活AMPK;4)以Western blot及Q-PCR技术检测不同类型细胞中硫化物醌氧化还原酶(SQR)的表达;5)利用慢病毒在不表达SQR的原代神经元中过表达SQR以及在原代小胶质细胞中敲减内源性SQR表达,以探讨SQR是否介导H2S供体的线粒体解偶联作用;6)采用siRNA技术进一步确认H2S供体激活AMPK的作用是依赖于SQR介导的线粒体解偶联作用;7)利用线粒体呼吸链复合物Ⅰ特异性抑制剂Rotenone探索H2S缓释供体ADT-OH的线粒体解偶联作用是否依赖于H2S氧化导致的线粒体呼吸链复合物Ⅰ水平的反向电子传递(RET),以线粒体NAD+/NADH比值作为检测呼吸链复合物Ⅰ水平的RET的替代指标;8)利用Rotenone探索使线粒体解偶联的H2S供体诱导的AMPK活化效应是否是依赖于线粒体复合物Ⅰ水平的RET;9)从缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation,OGD)处理后的原代神经元收得条件上清(OGD Neuron CM),以OGD Neuron CM处理原代小胶质细胞或BV-2小胶质细胞系建立离体脑缺血模型。在这一细胞模型,探索脑缺血后H2S供体ADT-OH诱导的AMPK的活化是否依赖于SQR;并通过实时荧光定量PCR检测细胞内炎症因子、ELISA(酶联免疫吸附)检测细胞培养基中炎症因子的表达;通过Western blot技术检测AMPK活化效应。实验结果:1)无机 H2S 供体 NaHS(20-200μM)、缓释 H2S 供体 ADT-OH(50-100μM)、5a(50-150μM)均能够降低细胞内ATP水平及升高AMPK活化水平。在ZnCl2存在下,上述H2S供体对ATP及AMPK激活的作用被逆转。在检测候选药物对线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性的影响实验中发现:NaHS(20-200μM)抑制线粒体呼吸链复合物Ⅳ的活性,而缓释供体ADT-OH(50-100μM)、5a(50μM)激活AMPK但不抑制线粒体呼吸链复合物Ⅳ的活性。这些结果提示NaHS通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅳ的活性激活AMPK,而缓释H2S供体ADT-OH、5a(50μM)、可能通过其他机制激活AMPK。2)H2S 供体 ADT-OH(50-100μM)、5a(50μM)在 ATP 合成酶抑制剂Oligomycin(寡霉素)存在时升高细胞氧消耗(OCR值),并降低线粒体内膜电位;这些结果表明缓释H2S供体ADT-OH和5a具有线粒体解偶联作用。3)Western blot及Q-PCR结果显示SQR表达于原代小胶与原代星型胶质细胞中而在原代神经元中不表达。4)在原代神经元细胞中ADT-OH(50-100μM)、5a(50μM)在ATP合成酶抑制剂Oligomycin(寡霉素)存在时不能提高细胞OCR值和降低细胞内ATP水平以及降低线粒体内膜电位(TMRM)。与此同时NaHS(20-200μM)、5a(100μM)则能够降低原代神经元细胞内ATP水平以及降低线粒体内膜电位;但在原代神经元细胞过表达SQR后H2S供体ADT-OH和5a在Oligomycin存在时升高OCR值,降低细胞内ATP的合成、降低线粒体膜电位。而在原代小胶中敲减SQR阻断H2S供体ADT-OH对OCR值、ATP含量、线粒体膜电位的影响,即ADT-OH的线粒体解偶联作用被抑制。这些结果表明缓释H2S供体通过SQR介导使线粒体解偶联。5)与对照(Vehicle)组相比,单纯的H2S供体ADT-OH与鱼藤酮(线粒体复合物Ⅰ的抑制剂)处理均升高线粒体NADH的含量,降低线粒体内NAD+/NADH比值。而ADT-OH与鱼藤酮共同处理小胶质细胞则是鱼藤酮抑制了ADT-OH升高线粒体NADH含量、降低NAD+/NADH比值的作用。结果提示ADT-OH能够导致线粒体呼吸链复合物Ⅰ水平的反向电子传递(RET)。在进一步探究RET与H2S诱导的线粒体解偶联作用中,发现鱼藤酮在小胶质细胞中抑制ADT-OH升高Oligomycin降低的OCR值的效应,同时抑制了 ADT-OH、5a(50μM)降低细胞内ATP的含量及降低线粒体膜电位的作用,而对另一线粒体解偶联剂氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)导致的ATP合成减少,膜电位降低的作用无影响。此外,5a(100-150μM)、NaHS对线粒体膜电位的降低,抑制细胞内ATP含量的效应均不能被鱼藤酮逆转。这些结果提示H2S供体ADT-OH和5a(50μM)诱导的线粒体解偶联依赖于RET。6)在无SQR表达的神经元细胞中,ADT-OH不能升高AMPK活化水平。同时小胶质细胞敲减SQR后,ADT-OH对AMPK的激化作用亦被抑制。在原代神经元中过表达SQR后,H2S供体ADT-OH显著激活AMPK。敲减SQR也抑制5a在50μM时对小胶质细胞AMPK的活化作用。但5a在100μM-150μM及NaHS均可激活原代神经元AMPK,上述结果提示5a在100μM-150μM及NaHS激活AMPK的作用不依赖于SQR介导的解偶联作用。而能够诱导线粒体解偶联的H2S供体激活AMPK是通过SQR介导线粒体解偶联作用激活AMPK。SQR介导的线粒体解偶联作用依赖于线粒体呼吸链复合物Ⅰ水平的反向电子传递。在进一步探索中,我们发现鱼藤酮(线粒体复合物Ⅰ的抑制剂)可抑制ADT-OH激活AMPK的作用。上述结果表明H2S供体可通过SQR介导的线粒体解偶联激活AMPK。7)与溶剂组(Vehicle)及未经缺糖缺氧剥夺(OGD)处理的神经元收得的条件上清(Neuron CM)处理的小胶质细胞相比,OGD Neuron CM处理的小胶质细胞组的AMPK活化水平明显下降,加入ADT-OH后AMPK活化水平则有所上升。在小胶质细胞敲减SQR后,ADT-OH促进AMPK活化的作用亦被敲除。在小胶质细胞敲减SQR后,实时荧光定量PCR(Q-PCR)及酶联免疫吸附(ELISA)结果显示ADT-OH逆转了 OGD Neuron CM诱导的小胶质细胞M1极化,而促使其向M2方向极化,在敲除SQR/AMPK后,ADT-OH的逆转效应则不复存在。这些结果表明ADT-OH在体外脑缺血模型中能够通过SQR介导的AMPK的活化促进小胶质细胞M2方向的转化。结论:SQR介导H2S氧化导致的线粒体解偶联和下游AMPK激活是H2S信号传导途径之一,这一途径介导了缓释H2S供体在缺血模型中对神经炎症的抑制作用。