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高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)是一种经济、安全、有效的疾病防治措施,已广泛应用于一氧化碳中毒、缺血性脑病以及减压病等的治疗。在一定范围内,HBO暴露可以通过改善机体缺氧,调动内源性保护机制产生等发挥保护作用,其疗效与暴露时间、压强成正相关。但过度的HBO暴露则会对机体造成损伤。研究发现,活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成是介导HBO发挥利害作用的关键因素。合理的HBO暴露可适度增加ROS生成,动员保护机制产生,对抗机体损伤;过度的HBO暴露则能引起ROS大量累积,引发氧化应激损伤。因此,明确HBO下细胞内ROS的生成机制和变化规律,能为指导HBO在实践中应用提供依据,我们开展了以下研究:第一部分:高压氧诱导内皮细胞活性氧生成以及细胞内活性氧来源估算研究目的:探索基础状态以及HBO下人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endotheliums,HUVECs)中ROS的来源并建立ROS来源估算方法。研究方法:利用全细胞以及线粒体靶向的超氧阴离子荧光探针,线粒体呼吸链(mitochondrial respiratory chain,MRC)复合体II、NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)和黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)三条ROS生成途径的特异性抑制剂,以及流式细胞仪、共聚焦显微镜和酶标仪三种检测工具,检测了基础状态以及280kPa-60 min HBO暴露下HUVECs中ROS的产生,并估算了不同状态下细胞内各ROS来源的比例。研究结果:HBO暴露使线粒体ROS增加至基础状态的2.14-2.44倍,全细胞ROS增加至1.32-1.42倍,MRC复合体II抑制剂分别抑制了30%及16%的线粒体及全细胞HBO诱导ROS。NOX以及XO抑制剂不影响HBO诱导ROS的产生。通过ROS来源比例算法估算,线粒体ROS占基础全细胞ROS的32%-39%,其中至少3%来自MRC复合物II,而NOX至少占24%-29%。HBO暴露后,几乎所有HBO诱导的ROS都来自线粒体,MRC复合体II至少占这部分的45%-60%。研究结论:建立了一种简单有效的方法来估算细胞内ROS的来源,并证明线粒体中的MRC是HBO诱导HUVECs ROS产生的主要来源。第二部分:不同方案高压氧下脊髓神经元活性氧生成规律研究目的:探究不同方案HBO下原代大鼠脊髓神经元ROS的生成规律,进一步验证ROS估算方法。研究方法:利用超氧阴离子以及总ROS荧光探针,MRC复合体II、NOX1/4、NOX2、XO以及单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的特异性抑制剂,检测21、100、145、190、235、280 kPa-60 min HBO方案以及15、30、45、60、90、120 min-280kPa HBO方案下原代大鼠脊髓神经元ROS的产生情况。研究结果:基础状态下,MRC复合体II ROS占神经元ROS的3%-4%,NOX至少占35%-38%,MAO至少占19%-20%,XO约占3%-6%。280 kPa-60 min HBO暴露后,MRC复合体II至少占HBO诱导ROS的44%-50%,而其他途径并未参与HBO诱导ROS生成。不同压强方案下,ROS随暴露压强增加而增长,超过235 kPa后增长不再显著。不同时程方案下,ROS随暴露时程延长而增长,超过60 min后增长不再显著。不同方案下ROS的增长均主要来自MRC复合体。研究结论:MRC是脊髓神经元中HBO诱导ROS的主要来源。一定范围内,ROS水平随着HBO暴露的压强与时程增加而增长,当压强超过235 kPa,时程超过60 min后ROS增长进入平台期。