【摘 要】
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氧杂蒽衍生物是一类具有多种应用潜力的化合物,在工业、医疗以及食品添加剂中有很大的前景。本实验室前期通过向大肠杆菌饲喂Toluquinol,发现一类具有氧杂蒽核心的荧光素类化合物—Arthrocolins。由于Arthrocolins对卵巢癌细胞A2780抑制活性好,IC50值为0.5μM,以及对恢复耐氟康唑的白色念珠菌对氟康唑敏感性,IC50值为1.41μM,因此具有较大的应用价值。但因其生物合成
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氧杂蒽衍生物是一类具有多种应用潜力的化合物,在工业、医疗以及食品添加剂中有很大的前景。本实验室前期通过向大肠杆菌饲喂Toluquinol,发现一类具有氧杂蒽核心的荧光素类化合物—Arthrocolins。由于Arthrocolins对卵巢癌细胞A2780抑制活性好,IC50值为0.5μM,以及对恢复耐氟康唑的白色念珠菌对氟康唑敏感性,IC50值为1.41μM,因此具有较大的应用价值。但因其生物合成产量极低,发酵罐发酵时产量更低,对其模块来源进行解析发现,苯基模块及吲哚模块来源于大肠杆菌自身的莽草酸途径。因此本研究根据提高大肠杆菌中莽草酸途径产物的有关报道,从优化大肠杆菌产Arthrocolins发酵条件、高产菌株的筛选及构建、探索影响其产量条件等三方面进行研究,主要结果如下:1、Arthrocolins的发酵条件优化:YN培养基（0.5%酵母提取物、1%Na Cl）培养时可提高大肠杆菌OP50中Arthrocolins的产量,其较LB培养基中OP50的产量提高了0.58倍;最适的p H为6-8;氧气是Arthrocolins合成的必要条件。瓶摇发酵时,培养时间不宜超过72h。培养48h后加入Toluquinol的Arthrocolins产量提高1.82倍,随后产量下降。发酵罐发酵时,OD600=5时加入前体且分批补料发酵下,Arthrocolins的产量提高。2、单基因敲除菌株的筛选及构建:对大肠杆菌BW25113单基因敲除菌株库Keio collection中的3901株突变株进行了筛选,其中Arthrocolins产量上升的单基因敲除菌株1310株,产量下降的有2587株。对其结果进行KEGG富集分析发现,敲除菌株中产量上调的基因大部分富集在ABC转运系统、氧化磷酸化、精氨酸和脯氨酸代谢以及β-内酰胺耐药性等四条通路中,其可能是影响了其前体转运及利用。而敲除菌株中产量下降的基因大部分富集在不同环境中的微生物代谢、双组分系统、糖代谢、糖酵解和糖异生、鞭毛组装、淀粉和蔗糖代谢、磷酸戊糖途径等七条通路中,说明糖代谢相关基因敲除均会使Arthrocolins的产量下降。利用p Cas/p Target F双质粒敲除系统对大肠杆菌OP50中的相应基因进行敲除,获得Δbcp和Δtrp D两株单基因敲除菌株,瓶摇条件下突变菌株的Arthrocolins产量较普通OP50菌株分别提高了55.87倍和68.96倍。3、糖对Arthrocolins中合成影响的探究:当培养基中的葡萄糖的含量为0.2%时,Arthrocolins的产量降低了近30倍;当葡萄糖含量达到0.4%时,Arthrocolins的产生会被完全抑制。分别用甘油、麦芽糖、乳糖、D-山梨醇、蔗糖、半乳糖、果糖以及蔗糖等对葡萄糖进行替换,发现除蔗糖以外,其余碳源均会抑制Arthrocolins的产生。以葡萄糖为例对碳源抑制Arthrocolins产生的原因进行探究。发现加入葡萄糖后,大肠杆菌的氧化还原电位会升高。对发酵液中相关合成前体的含量进行检测,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及Toluquinol三天内的含量均高于未添加葡萄糖的对照组,而三天内吲哚的含量则低于对照组,补充吲哚后依旧无法恢复其生产;将Toluquinone替代Toluquinol作为前体加入到添加了葡萄糖的培养基中,结果依旧未产生Arthrocolins,且发酵液中中未检测到Toluquinone,反而检测到了大量的Toluquinol,该结果说明葡萄糖不是通过抑制其前体而抑制Arthrocolins产生的,可能是由于减少了反应需要的自由基,从而导致无法产生Arthrocolins。对Arthrocolins的产量与大肠杆菌氧化还原电位以及氧化还原性物质的相关性进行研究,发现Arthrocolins的产量与氧化还原电位的变化没有直接联系,但自由基捕获剂GSH的加入会使Arthrocolins的产量降低,说明自由基的减少可以减少Arthrocolins的产量。
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