草鱼是我国最为重要的淡水鱼养殖品种,其产量约占我国淡水鱼养殖总量的20%。由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖造成了巨大的经济损失,严重影响了草鱼养殖业的健康发展。GCRV是我国分离到的第一个水生呼肠孤病毒,也是水生呼肠孤病毒中毒力最强,危害最大的病原,GCRV的基因组是分11个节段的双链RNA病毒,变异迅速和复杂的病原学及缺乏有效的防控措施是导致其广泛、快速、持续的流行主要原因。疫苗免疫是当前防控草鱼出血病最为有效的措施,其中灭活疫苗和减毒疫苗应用最为广泛,对于草鱼出血病的防控起到了积极作用。但灭活疫苗无法进入主要组织相容性复合体I（MHC I）类抗原呈递途径,无法有效的诱导细胞毒性T细胞（CTL）反应,抗原需求量大,免疫持续期短,免疫效果相对不理想。减毒疫苗则毒力返祖现象时有发生,有回复致病性的潜在风险。因此,急需开发更为高效和安全草鱼出血病新型疫苗。DNA疫苗安全性高,免疫保护持续时间较长,可以诱导早期免疫应答。它的作用机理是通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,从而诱导免疫动物产生对该目标抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。其技术手段是将编码某种已知目标抗原蛋白的外源基因克隆到真核表达载体上,然后将重组质粒DNA注射到动物体内来实现体内真核表达。与传统疫苗相比,基因疫苗具有可与其他免疫原组成多价疫苗、免疫效果好、生产成本低、保护期长和安全性好等优点。因此,本研究以当前流行的Ⅱ型GCRV（GCRV-Ⅱ）主要结构蛋白编码基因S6为目的基因,构建真核表达重组质粒p VAX1-S6,然后对该重组质粒的体外表达效果和抗原性进行鉴定,通过鱼体试验来评价其免疫效果,来评估基于GCRV-ⅡS6基因的DNA疫苗可行性,主要研究内容包括以下两个部分:（1）重组质粒的构建及体外表达鉴定本文以GCRV-Ⅱ的新流行株Hu Nan1307为研究对象,将它的S6基因完整ORF采用PCR方法扩增出来,克隆到真核表达载体p VAX1,经酶切验证后大量提取p VAX1-S6质粒。用脂质体转染法将其转染至真核细胞FHM进行瞬时表达,间接免疫荧光并用荧光显微镜进行观察。同时对S6基因表达蛋白用Western blot法进行鉴定。结果表明,GCRV-ⅡS6基因成功的克隆入p VAX1载体中,获得p VAX1-S6质粒;重组质粒在FHM细胞中成功表达,并经Western blot鉴定,获得表达蛋白大小为70 k Da左右。（2）DNA疫苗的体内试验（鱼体免疫试验）本实验将草鱼分PBS对照组,p VAX1空载体组,弱毒疫苗组,核酸疫苗p VAX1-S6组四组进行免疫注射,并在两周后部分接种病毒。通过荧光定量方法检测免疫后12周内6个免疫相关基因的相对表达量的变化,并通过ELISA方法检测免疫草鱼体内的特异性抗体变化,监测免疫草鱼对强毒攻击的保护效果。通过这些指标来评价该基因工程疫苗对草鱼的免疫效果。结果表明,核酸疫苗p VAX1-S6免疫草鱼后,草鱼体内产生了抗体,并长期维持较高水平;草鱼的6个免疫相关基因的相对表达水平都上调,之后有所下降;重组DNA疫苗对免疫草鱼的保护率在80%以上。结论:构建的S6基因重组质粒p VAX1-S6体外表达效果良好,表达出来的蛋白可以很好的识别针对GCRV-Ⅱ的抗体,显示具有良好的免疫原性;将p VAX1-S6核酸疫苗通过肌肉注射免疫草鱼,可以诱导产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,且免疫过的草鱼对强毒感染的相对保护率达80%,表明p VAX1-S6核酸疫苗对GCRV-Ⅱ强毒株具有较好的免疫保护效果,是一种较为理想的候选疫苗。