随着环境污染、吸烟、电离辐射等因素的影响，肺癌的发病率逐年增高，且已经成为癌症相关性死亡的首要原因，最新文献报道，肺癌所致的死亡比肠癌、乳腺癌、前列腺癌的总和还多。而且肺癌发病率仍在逐年增加，发病的高峰仍没来临，特别是在中国，同时肺癌的预后较差，虽然肺癌的综合治疗取得一定的发展，但其5年生存率仅10%-15%，且几十年来改善不明显。根据组织学类型分类，非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的85%左右。目前研究表明体力状态、疾病分期、年龄、性别、体重下降是与肺癌预后相关的独立危险因素，但是没有确切可靠的生物标志物能准确地指导个体化的治疗及确切地判断预后。因此目前迫切需要更好的了解NSCLC的侵袭、转移的分子机制，找到用于预防、诊断及治疗的标志物，降低NSCLC的发病率，提高其早期诊断率，同时为NSCLC的治疗提供个体化指导，从而改善NSCLC患者的预后。Raf激酶抑制蛋白（Raf-1kinase inhibitor protein, RKIP）是一个保守的蛋白，是磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine-bindingprotein, PEBP）家族成员。最初研究认为RKIP是RAF-MEK-ERK信号通路的抑制蛋白之一。基于这些调节途径，RKIP在许多生理和病理过程中发挥重要作用。人类RKIP基因位于染色体12q24.23位点，其mRNA长度为1507个核苷酸，由4个外显子转录而产生，在细胞膜的生物合成、神经生长和凋亡的病理生理过程中起着一定的作用。最近的研究表明，RKIP不仅干扰了Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号转导途径，而且抑制NF-κB和G蛋白偶联受体激酶的信号转导。RKIP的低表达与许多肿瘤的发生、发展、侵袭及转移有关，这些肿瘤包括前列腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌等，但在肺癌中的报道不多。NSCLC之所以预后差与其肿瘤的侵袭与转移有关，同时肺癌细胞的这种生物学行为也影响肺癌患者的治疗效果，是导致患者死亡的主要原因之一。NSCLC的侵袭、转移是极其复杂的过程，涉及癌细胞、机体、组织间的相互影响和作用。因此探讨肺癌侵袭与转移的分子机制是目前研究的热点，RKIP与多种肿瘤的侵袭及转移有关，但在肺癌的研究较少，且其机制目前不明，本研究首先收集经手术病理证实的NSCLC手术标本，行组织芯片/免疫组化及RT-PCR检测明确RKI在NSCLC癌组织、癌旁正常组织的表达是否存在差异，同时分析RKIP的表达与临床特征及预后的相关性，最终以明确RKIP与肺癌的侵袭、转移是否相关，进一步在体外利用肺癌细胞系进行研究，通过质粒转染在肺癌细胞中高表达RKIP，研究RKIP表达水平与肺癌细胞的增殖、活力、侵袭、迁移是否存在一定的相关性，并深入探讨RKIP是否通过抑制上皮间质细胞转化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT）来实现其抑制肿瘤细胞的侵袭及转移作用的。第一部分RKIP在非小细胞肺癌中的表达及其与预后的相关性目的：近期研究发现，Raf-1kinase inhibitor protein （RKIP）与许多肿瘤的发生、发展、侵袭、转移有关，包括有前列腺癌、黑色素瘤、肠癌、肝癌、乳腺癌等，但RKIP在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）中的表达情况及其与预后的相关性目前研究甚少，本研究旨在明确RKIP在NSCLC癌组织中的表达情况及其与预后的相关性。方法：收集手术切除的经常规病理证实的NSCLC标本及患者的基本临床特征，提取癌组织和癌旁正常组织的RNA，采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timequantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）检测癌组织及癌旁正常组织中RKIP表达的差异及与临床病理特征的相关性，同时采用组织芯片（TissueMicroarray, TMA）/免疫组化（Immunohistochemical, IHC）法分别检测有随访资料的75例肺腺癌癌组织和癌旁正常组织中RKIP蛋白水平的表达情况，明确其与预后的相关性。结果：RT-PCR结果提示RKIP mRNA在NSCLC癌组织总的表达明显低于癌旁正常组织（分别为1.601±0.072vs2.637±0.042, P<0.001），NSCLC癌组织中RKIP mRNA表达下调与于淋巴结分期（P=0.019）和病理TNM分期（P=0.015）呈正相关。组织芯片免疫组化结果提示RKIP的蛋白表达与临床病理特征无明显的相关性，生存分析提示RKIP高表达组的肺腺癌的生存明显好于低表达组（P=0.028），但多因素分析提示RKIP不能作为独立的预后判断因子（HR0.583,95%CI0.369-1.828）。结论：RKIP在NSCLC癌组织中的表达较癌旁正常组织为低，同时其mRNA表达的下降与肿瘤的淋巴结转移及病理TNM分期有关， RKIP蛋白高表达组的生存明显好于低表达组，上述结论提示RKIP与肿瘤的侵袭及转移相关，且有一定的预后判断价值。第二部分RKIP影响A549细胞的侵袭、转移及其机制的研究目的：在前列腺癌、肠癌等细胞系的研究中发现，Raf-1kinase inhibitor protein（RKIP）与癌细胞的侵袭及迁移有关，但在肺癌中的研究较少，本研究旨在探讨在肺癌细胞系中RKIP的异常表达是否与癌细胞的侵袭及迁移有关，并探讨其可能的机制。方法：构建RKIP-GV141质粒，经测序证实质粒构建成功，以空白载体作为对照，转染A549细胞后行实时荧光定量聚合酶链反应（Real-1time quantitative reversetranscription polymerase chain reaction, RT-PCR）、蛋白印迹（Western blot，WB）测定其转染后RKIP mRNA和蛋白水平的变化，验证转染效率；分别采用克隆形成实验（ColonyFormation Assay）、细胞活力实验MTT验证RKIP高表达对A549细胞增殖及活力的影响；transwell、划痕实验证实RKIP可以影响肿瘤的侵袭及转移。RKIP-GV141转染后收集A549细胞，提取总蛋白，测定上皮细胞标志物E-钙粘蛋白和间充质细胞标志物波形蛋白的变化，从而验证RKIP对NSCLC侵袭及转移的作用是否与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition, EMT）相关。结果：RT-PCR和westernblotting分析表明无论是蛋白水平还是RNA水平，RKIP能在RKIP-GV141转染的A549细胞中表达，而在空白对照载体转染的细胞中基本没有表达。克隆形成实验表明RKIP的高表达抑制A549细胞的增殖；MTT实验提示RKIP降低A549细胞的活性；划痕实验表明RKIP降低A549细胞的转移能力；Transwell迁移实验和基质胶侵袭实验验证RKIP的表达影响肿瘤的侵袭及迁移。转染后采用Westernblotting测定提示E-钙粘蛋白升高及波形蛋白表达下降，提示RKIP影响A549细胞侵袭及迁移的机制可能为抑制EMT。结论：RKIP-GV141可以成功转染A549，转染后A549细胞的增殖、活性、迁移、侵袭能力均下降，表明在体外RKIP影响A549细胞的侵袭及转移能力，且E-钙粘蛋白