研究背景卵巢功能早衰(premature ovarian failure, POF)是指月经初潮年龄正常或青春期延迟、第二性征发育正常的女性在40岁之前出现持续性不可逆性闭经(>12个月),伴高促性腺激素状态：血清卵泡刺激素(FSH)>40IU/L及雌二醇(E2)<25pg/ml,并出现雌激素缺乏的症状：如性欲减退、潮热、出汗、骨质疏松、闭经等,甚至导致不孕。据统计,40岁以前POF发生率为1%,30岁以前发生率为1‰。原发性闭经中POF占20%～25%,继发性闭经中占10%～20%。卵巢早衰具体的发病机制尚不清楚,其可能的原因包括：①相关基因异常：如X染色体的缺失、易位和点突变等；②免疫因素：据统计,大约10%～15%的POF与免疫因素有关。自身免疫性POF患者常合并其他自身免疫性疾病,如阿狄森(Addison)氏病,系统性红斑狼疮(SLE)等；③感染：如盆腔炎、流行性腮腺炎病史,风疹、麻疹病毒感染史等；④酶缺陷：研究证实7-α羟化酶及17,20碳链裂解酶等甾体激素合成关键酶的缺乏与POF相关；⑤医源性因素：如放疗、化疗等；⑥农药等毒物接触史,吸烟、吸毒等；⑦心理因素；⑧其他。随着化疗药物的广泛应用,许多恶性肿瘤和自身免疫性疾病患者的病情得到控制或缓解,寿命延长。但年轻女性患者面临的一个问题是化疗本身引起的卵巢损伤,可导致患者出现潮热、骨质疏松、闭经等低雌激素症状,甚至导致POF,引起不孕,给患者带来一系列生理、心理、社会问题。如何减轻或预防化疗所致的卵巢损伤,成为目前研究的热点。化疗引起卵巢损伤的具体原因尚不清楚,可能的机制为化疗药物损伤卵巢颗粒细胞及卵母细胞,导致颗粒细胞凋亡及卵母细胞闭锁。研究发现,细胞有丝分裂越活跃,化疗药物对其杀伤性越大。化疗引起卵巢损伤主要与化疗药物的种类、剂量、累积剂量及患者年龄等相关。引起卵巢损伤最主要的药物是烷化剂,烷化剂中主要是环磷酰胺(CTX)。化疗药物的剂量及累积剂量越大,对卵巢的损伤越严重。患者年龄越小越不容易发生POF,其导致POF所需的化疗药物剂量也越大。预防或减轻化疗导致的卵巢损伤,缓解由于低雌激素导致的潮热、出汗、烦躁、骨质疏松等临床症状,目前临床上主要的方法有：①药物：如促性腺激素释放激素类似物(GnRH-a)、口服避孕药等。②冷冻技术：包括冷冻胚胎、冷冻卵母细胞和体外成熟、冷冻卵巢及移植等。而目前尚无特别有效、安全及可长期使用的方法。目前临床上常用GnRH-a预防化疗引起的卵巢损伤,但对已经造成的损伤则没有作用,且长期使用有较重的并发症,价格较贵也限制了它的临床应用。补充性激素是目前临床最常用的方法,但雌激素在某些激素依赖性肿瘤中的应用受到限制：如乳腺癌、子宫内膜癌等。冷冻保存技术尚不成熟,目前主要是处于研究阶段。生长分化因子-9(growth differentiation factor-9, GDF-9)是由卵母细胞分泌的细胞因子(糖蛋白)。大量研究证实其在卵泡的发育过程中起着不可缺少的作用。卵泡发育分为不依赖促性腺激素阶段和依赖促性腺激素阶段：从始基卵泡到初级卵泡(窦前卵泡),此阶段不受生殖激素的调节,以后则在促性腺激素及甾体激素的作用下发育成为成熟卵泡,而GDF-9主要在前一阶段起作用。GDF-9能通过旁分泌方式对卵泡的生长和分化起着重要的作用,促进卵母细胞的正常生长及有丝分裂。有研究发现,将人卵巢上皮组织培养于存在或缺少重组小鼠GDF-9的培养基中,一周后发现加入了重组GDF-9的培养基中的卵泡有53%达到第二阶段,同时发现卵泡的活力也有所增强,而对照组仅31%达到第二阶段。另有研究证实,GDF-9在体外可使人类卵巢组织中大量始基卵泡生长启动,减少卵泡闭锁,促进卵泡存活。Shimizu T等研究发现,直接给母猪卵巢注射猪的GDF-9基因片段,可促使卵泡发育,初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡的数量增加,原始卵泡数量减少。通过RNA干扰技术,体外阻断窦前卵泡向窦状卵泡过渡期GDF-9的表达,发现窦前卵泡的基础发育及FSH诱导的发育均受阻。GDF-9基因敲除的小鼠卵泡受阻在初级卵泡阶段,不形成优势卵泡,无法排卵,导致不孕。Gilchrist等发现,卵母细胞分泌的GDF-9的活性可被特异性抗GDF-9抗体mAB-GDF-9-53中和,使卵泡停滞在初级卵泡阶段,而不引起卵泡闭锁。目前,GDF-9与POF的关系成为研究热点。有报道在POF患者中发现了GDF-9基因的点突变,有理由认为GDF-9突变可能是POF的发病原因之一。化疗的细胞毒性常作用于分裂增殖期的细胞,处于静止期的卵泡可防止受损害。化疗药物中以烷化剂最容易引起卵巢损伤,而烷化剂中以CTX最具有代表性,CTX在体外无活性,磷酰胺氮芥(Glyciphosphoramide, PM)为其最终代谢产物,具有体外活性。为此,本研究采用PM作为引起体外培养大鼠卵巢损伤的药物,建立体外培养大鼠卵巢损伤的模型,在给予PM的同时加入抗GDF-9抗体中和GDF-9,观察是否可使卵泡发育停滞在早期阶段,阻止原始卵泡向成熟卵泡转变,使卵巢中的卵泡尽可能多的处于对化疗药物低敏感的状态,从而减轻化疗对卵泡的损伤。第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氮芥的适宜剂量目的：观察不同剂量的磷酰胺氮芥(Glyciphosphoramide,PM)引起体外培养大鼠卵巢结构和内分泌功能损伤的情况,确定一个适宜浓度,作为建立体外培养大鼠卵巢损伤模型的剂量,并用于下一步的实验研究。方法：无菌条件下分离大鼠卵巢。实验分为4组,正常对照组及实验1、2、3组。每组12个卵巢,来源于出生8周的Wistar大鼠(体重180～200 g)。4组均先只加入1ml培养基(a-MEM+10%FBS+O.075IU/ml hMG+1%ITS+1%双抗),24h后更换全液,实验1、2、3组培养基中分别加入浓度为10μg/ml.20μg/ml、50μg/ml的磷酰胺氮芥(PM),正常对照组培养基中不含PM,培养48h后均隔天全量更换不含PM的培养基(即PM作用48h),共培养7d(即加入PM的6d)。在加入PM前及加入后2d(48h)、6d时更换的培养基用放射免疫法测定其雌二醇(E2)浓度。加入PM6d时取出大鼠卵巢,HE染色,显微镜下计数各级卵泡总数。结果：1.E2浓度：(1)加入PM前4个组E2浓度差异无统计学意义(F=0.061,P=0.979)；两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)加入PM2d,4个组E2浓度比较差异有统计学意义(F=2838.356,P=0.000)。组间两两比较差异也均有统计学意义(P<0.05),其中3个实验组E2浓度(11.99±0.82 pg/ml；9.32±0.65pg/ml；4.53±1.04 pg/ml)均低于正常对照组(77.27±2.13 pg/ml),且PM剂量越大,E2浓度降低越明显。(3)加入PM6d,4个组E2浓度比较差异亦有统计学意义(F=212.488,P=0.000)。组间两两比较差异也均有统计学意义(P<0.05),3个实验组E2浓度(20.90±5.48 pg/ml；16.24±6.07 pg/ml；7.47±2.00 pg/ml)均低于正常对照组(89.23±5.96 pg／ml)。同样,PM剂量越大,E2浓度降低越明显。2.卵泡总数：加入PM6d,4组比较各级卵泡总数差异均有统计学意义(F=731.215,P=0.000)。组间两两比较差异亦均有统计学意义(P<0.05),其中3个实验组的各级卵泡总数(64.50±16.17个；28.63±13.15个；19.42±8.39个)均较正常对照组(100.15±9.18个)少,且PM剂量越大,各级卵泡总数减少越明显。结论：3种不同浓度的PM均可导致本实验的E2浓度下降和各级卵泡总数减少,与正常对照组比较差异均有统计学意义,且PM剂量越大,大鼠的卵巢结构及内分泌功能损伤越重,即E2浓度下降及各级卵泡总数减少越明显,故我们选择了3个剂量中最低的PM浓度——10μg/ml作为建立体外培养大鼠卵巢损伤模型的适宜剂量,并用于下一步的实验研究。第二部分抗生长分化因子-9抗体对PM所致大鼠卵巢损伤的治疗作用的体外实验研究目的：探讨抗生长分化因子-9抗体(Anti-GDF-9)对化疗所致的体外培养大鼠卵巢损伤是否具有治疗作用。方法：实验分为4组,共28个卵巢(14只Wistar大鼠),其中：①正常对照组6个；②PM组6个；③生理盐水组6个：加入1ml含0.075IU/ml hMG的生理盐水；④PM+抗体组10个：先加入10μg/ml的PM,24h后加入Anti-GDF-9 (5μg/ml)。正常对照组和生理盐水组培养基中不含PM。PM均为单次给药,作用48h后4组均隔天全量更换不含PM的培养基(或生理盐水)。正常对照组、PM组、生理盐水组的卵巢共培养8d,而PM+抗体组有6个卵巢培养8d,4个卵巢培养14d。培养8d及14d时按上述要求分别取出标本,HE染色,显微镜下计数各级卵泡总数。结果：1.培养8d,4组各级卵泡总数比较差异有统计学意义(F=324.403,P=0.000)。PM+抗体组各级卵泡总数与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中PM+抗体组各级卵泡总数(39.90±7.52个)少于正常对照组(55.92±11.78个),但较PM组(32.38±13.37个)和生理盐水组(12.21±4.82个)多。(2)PM+抗体组培养8d各级卵泡总数(39.90±7.52个)与培养14d(40.37±8.59个)比较,差异无统计学意义(t=0.375,P=0.709)。结论：体外培养大鼠卵巢8d,PM+抗体组的卵泡总数虽较PM组多,但仍少于正常对照组,差异有统计学意义。且PM+抗体组随着培养时间的延长(从8天到14天),各级卵泡总数的差异并无统计学意义,说明卵巢功能没有恢复。实验提示我们加入PM24h后再加入Anti-GDF-9并不能减轻PM所致的体外培养大鼠卵巢功能的损伤,根据统计结果,尚不能得出有治疗作用的结论,但因样本量较小,增加样本量是否得出同样的结论,尚需进一步的研究。第三部分抗生长分化因子-9抗体对化疗所致体外培养大鼠卵巢损伤的保护作用的实验研究目的：从大鼠卵巢结构和内分泌功能的改变,进一步探讨Anti-GDF-9对化疗所致的体外培养大鼠卵巢损伤是否具有保护作用,为体内实验和临床试验提供理论依据。因上述实验PM+抗体组是在加入PM24h后方加入抗体,经统计学分析,PM+抗体组对化疗所致的体外培养大鼠卵巢损伤的治疗作用不明显。下步的实验结合抗体的中和作用原理,先加入抗体(Anti-GDF-9),用于中和卵母细胞分泌的生长分化因子-9 (growth differentiation factor 9,GDF-9),24h后再加入PM,观察能否使卵泡停滞在早期发育阶段,从而减轻化疗对体外培养大鼠卵巢的损伤,起到保护作用。方法：无菌条件下收集Wistar大鼠的卵巢,共96个(48只大鼠),随机分为3组,每组32个卵巢：①正常对照组；②PM组：加入10μg/ml的PM；③实验组：在给予PM前24h加入Anti-GDF-9。正常对照组与PM组先只加入1ml培养基,实验组另在培养基中加入Anti-GDF-9(5μg/ml)培养24h后均全量更换培养基,其中正常对照组仍只加入1ml培养基,PM组和实验组均另在培养基中加入10μg/ml的PM,48h后3组均隔天全量更换不含PM的培养基(即PM只作用48h),共培养7d(即加入PM的6d)。在加入PM前及加入PM2d、4d、6d时每组各时间点均分别取出8个大鼠卵巢,用HE染色、切片,显微镜下计算各级卵泡总数；另外,在上述的各时间点将更换下来的培养基用放射免疫法测量其E2浓度。结果：1.E2浓度：(1)加入PM前,3组E2浓度差异无统计学意义(F=0.687,P=0.514),两两比较差异也均无统计学意义(P>0.05)。(2)加入PM2d,3组E2浓度差异均有统计学意义(F=51.662,P=0.004).其中实验组(94.82±85.24 pg/ml)和正常对照组(85.66±20.57pg/ml)差异无统计学意义(P=0.987),而实验组E2浓度明显高于PM组(7.63±7.01pg/ml),有显著性差异(P=0.000)。(3)加入PM4d,3组E2浓度差异仍有统计学意义(F=25.125,P=0.000)。其中实验组E2浓度(43.39±10.45 pg/ml)明显高于PM组(6.29±4.84 pg/ml),有显著性差异(P=0.000)。而实验组E2浓度和正常对照组(59.30±23.83 pg/ml)比较,差异无统计学意义(P=0.050)。(4)加入PM6d,3组E2浓度差异均有统计学意义(F=17.972, P=0.000)。其中实验组E2浓度(41.71±17.03 pg/ml)高于PM组(11.24±8.39pg/ml),差异有统计学意义(P=0.000)；而实验组E2浓度和正常对照组(50.78±14.58pg/ml)比较,差异无统计学意义(P=0.203)。2.卵泡总数：(1)加入PM前,3组各级卵泡总数差异无统计学意义(F=0.034,P=0.966)。(2)加入PM2d,3组各级卵泡总数差异有统计学意义(F=47.074,P=0.000)。两两比较卵泡总数差异均有统计学意义(P<0.05),其中实验组各级卵泡总数(67.50±9.90个)多于PM组(36.13±8.20个),但少于正常对照组(89.38±14.14个)。(3)加入PM4d,3各级组卵泡总数差异有统计学意义(F=35.355,P=0.000)。其中实验组各级卵泡总数(56.50±14.57个)与正常对照组(66.88±11.33个)比较差异无统计学意义(P=0.088),而实验组各级卵泡总数明显多于PM组(20.50±7.83个),有显著性差异(P=0.000)。(4)加入PM6d,3组各级卵泡总数差异亦有统计学意义(F=41.865,P=0.000)。其中实验组各级卵泡总数(49.25±9.08个)与正常对照组(48.75±11.51个)比较差异无统计学意义(P=1.000),而实验组各级卵泡总数多于PM组(12.88±5.87个),差异有统计学意义(P=0.000)。结论：体外实验,在加入PM前24h加入Anti-GDF-9,能减轻PM所致体外培养大鼠卵巢损伤所引起的E2浓度降低和各级卵泡总数的减少,经统计分析,与PM组比较差异均有统计学意义,而与正常对照组比较差异均无统计学意义。因此,Anti-GDF-9对PM所致体外培养大鼠卵巢损伤具有一定的保护作用。但本实验采用的化疗药物剂量较小,在较大化疗剂量的情况下能否减轻化疗对大鼠卵巢的损伤；体内实验是否还会具有同样的结果,尚需进一步研究。另外,由于种属差异,本研究结果是否适用于人类也有待于进一步研究。