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胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，超过35％的胃癌病例发生在中国。在中国，胃癌是常见癌症第2位和恶性肿瘤死因第2位。胃癌早期缺乏特异性临床表现，发现时多处于局部进展期或晚期，并且恶性程度高，对传统治疗反应差。尽管近年来胃癌的死亡率有下降趋势，但胃癌患者整体预后较差，5年生存率仍然很低。迄今为止，胃癌发生发展的分子机制尚不清楚，能够用于诊断、治疗和预后的生物标志物非常有限。因此，探索胃癌发生发展的机制以及寻找有效的生物靶标对于胃癌早期诊断、评估预后以及靶向治疗具有重要意义。
长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的非编码RNA分子，其自身不具有蛋白编码功能，曾被科学家认为是人类基因组序列中的转录“噪音”。随着对lncRNA研究的不断深入，lncRNA在疾病发生尤其是肿瘤的发生发展中发挥的作用受到越来越多的关注。研究表明，lncRNA在肿瘤中扮演了不同的角色，作为致癌基因或抑癌基因调控肿瘤的发生;通过诱导上皮细胞间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)促进肿瘤的侵袭和转移;引起肿瘤细胞产生多药耐药(multidrug resistance，MDR)，从而对化学治疗抵抗。lncRNA通过参与多种复杂的调控机制，如转录调控、转录后调控以及表观遗传学调控等，影响肿瘤的生物学进程。一些lncRNA在多种肿瘤（包括胃癌）中异常表达，对肿瘤的诊断和预后具有潜在价值。
lncRNA和miRNA的相互作用在肿瘤的发生发展中起了重要的调节作用。2011年，Salmena提出竞争性内源性RNA（competitive endogenousRNA，ceRNA）假说，这个假说认为：lncRNA、mRNA或其他的RNA分子，可以作为天然mRNA“海绵”，通过共同的miRNA反应元件(microRNA response elements，MREs)与miRNA结合从而影响miRNA导致的基因沉默。ceRNA假说揭示了一种RNA间相互作用的新机制。胃癌中lncRNA与miRNA或lncRNA与mRNA之间也存在着复杂的调控网络关系，这些调控网在胃癌的发生发展中起了重要的作用。对这些网络的深入研究，将有助于进一步了解胃癌的发病机制和演进过程。
癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)是由美国国家癌症研究所(NCI)和国家人类基因组研究所(NHGRI)建立的癌症测序数据库，收集了超过11000例包括33种肿瘤的癌症基因图谱，并且数据全部免费开放。随着基因组学和生物信息学技术的不断进步，lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络已经在多种肿瘤包括肺癌、肠癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌中得到构建，并且越来越多的具有ceRNA功能的lncRNA被研究发现，它们有望成为肿瘤诊断、治疗和预后的潜在靶点。
本研究中通过TCGA数据库和生物信息学技术构建胃癌lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络，进一步验证ceRNA网络中部分lncRNA的表达，并筛选出对胃癌细胞生物学功能影响最大的lncRNA_LINC00200作为研究对象，从体外细胞实验和体内动物模型探索和验证LINC00200调控胃癌生物学进程的潜在机制，以期为胃癌的诊断和治疗提供有价值的生物学靶标。
第一部分 基于TCGA数据库的胃癌相关长链非编码RAN差异表达谱及ceRNA调控网络的分析
目的：通过TCGA数据库和生物信息学技术，构建胃癌lncRNA-miRNA-mRNAceRNA网络，分析差异表达mRNA的作用通路，发现与胃癌患者预后相关的RNA分子。
方法：从TCGA数据库获取372例胃癌样本以及32例癌旁组织样本的RNA序列，通过“edgeR”软件分析得出胃癌差异表达lncRNA，miRNA和mRNA。用GO功能注释和KEGG通路分析得出差异表达mRNA的功能富集通路。用R语言中的生存软件分析差异表达RNA与患者预后的关系。
结果：根据差异表达倍数的10g2绝对值大于等于2且校正后P值小于0.01的标准，发现胃癌组织中有999个差异表达lncRNA，137个差异表达miRNA和1629个差异表达mRNA。GO功能注释发现差异表达mRNA主要富集在生物进程，细胞成分和分子功能上。KEGG通路分析显示差异表达mRNA参与了肿瘤相关通路的调控，如癌症转录失调，调节干细胞的信号通路，P53信号通路，PI3K-Akt信号通路。根据数据库预测和生物信息学技术分析，最终65个差异表达lncRNA，9个差异表达miRNA以及24个差异表达mRNA参与构建ceRNA调控网络。在ceRNA调控网络中，9个lncRNA与患者总生存相关（P＜0.05），6个mRNA与患者总生存相关(P＜0.05)。
结论：基于TCGA数据库大样本胃癌标本数据分析，得出胃癌差异表达RNA谱，构建胃癌lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网。这个网络精确而复杂地展示了RNA分子间相互调控的新机制，对研究胃癌的发生发展具有重要意义。
第二部分 胃癌中差异表达lncRNA的体外验证及功能研究
目的:为了验证TCGA数据库和生物信息学分析结果的准确性和可靠性，随机选择ceRNA调控网络中不同差异表达倍数的5个lncRNA进行体外细胞验证和初步功能探索。
方法:随机选取ceRNA网络中5个差异表达lncRNA，Real-time PCR检测5个lncRNA在正常胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞株SGC-7901中的差异表达。用siRNA干扰lncRNA表达，CCK8，Transwell以及细胞划痕实验分别检测干扰前后lncRNA对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。
结果:随机选取的5个lncRNA中，4个lncRNA (ERVMER61、DSCR4-IT1、HULC、LINC00200)在SGC-7901细胞中表达明显高于GES-1，与TCGA数据库预测结果一致。采用siRNA干扰后，SGC-7901胃癌细胞中5个lncRNA的表达显著降低。CCK8实验和Transwell侵袭实验发现ERVMER61、DSCR4-IT1、HULC、LINC00200敲减后SGC-7901细胞增殖和侵袭能力受到抑制。划痕实验结果显示两个lncRNA(HULC、LINC00200)敲减后，SGC-7901细胞的迁移能力显著降低。
结论:根据生物信息学技术分析和严谨的实验，TCGA数据库可以有效地为我们提供有价值的生物学靶标。LINC00200作为影响胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的生物学标志物，值得我们进一步深入研究。
第三部分 LINC00200对胃癌细胞生物学功能的影响及其机制研究
目的:lncRNA在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，本部分研究探讨LINC00200在胃癌中的生物学功能及影响胃癌细胞生物学行为的机制。
方法:qRT-PCR检测LINC00200在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达。CCK8、Transwell侵袭以及细胞划痕实验检测干扰LINC00200表达对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。通过荧光素酶实验确定LINC00200与miR-143-3p以及miR-143-3p与SERPINE1的调控关系及结合位点。通过补救实验确定LINC00200调控miR-143-3p/SERPINE1通路影响胃癌的进展。
结果:LINC00200在胃癌组织和胃癌细胞株中显著高表达。敲低LINC00200的表达体外抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。机制研究表明，LINC00200作为ceRNA，通过miR-143-3p间接调控靶基因SERPINEl的表达，从而影响胃癌的生物学进程。
结论:LINC00200在胃癌中高表达，通过影响miR-143-3p/SERPINE1通路促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。LINC00200有望成为胃癌潜在的诊断和治疗靶标。
第四部分 LINC00200体内调控SERPINE1表达影响胃癌的生长
目的:体内实验评估LINC00200调控SERPINE1表达对胃癌生长的影响。
方法:将LINC00200稳定下调和SERPINE1稳定过表达的SGC-7901细胞，分别或同时接种于荷瘤小鼠皮下构建成瘤模型，观察小鼠皮下肿瘤的体积和称取肿瘤重量。
结果:LINC00200下调组的SGC-7901细胞，对荷瘤小鼠体内的肿瘤形成能力明显低于空白对照组;SERPINE1过表达组在荷瘤小鼠体内的肿瘤形成能力高于空白对照组。过表达SERPINE1可以逆转LINC00200下调导致的成瘤能力降低。
结论:LINC00200通过调控SERPINE1表达体内促进胃癌细胞的生长和肿瘤形成。
长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的非编码RNA分子，其自身不具有蛋白编码功能，曾被科学家认为是人类基因组序列中的转录“噪音”。随着对lncRNA研究的不断深入，lncRNA在疾病发生尤其是肿瘤的发生发展中发挥的作用受到越来越多的关注。研究表明，lncRNA在肿瘤中扮演了不同的角色，作为致癌基因或抑癌基因调控肿瘤的发生;通过诱导上皮细胞间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)促进肿瘤的侵袭和转移;引起肿瘤细胞产生多药耐药(multidrug resistance，MDR)，从而对化学治疗抵抗。lncRNA通过参与多种复杂的调控机制，如转录调控、转录后调控以及表观遗传学调控等，影响肿瘤的生物学进程。一些lncRNA在多种肿瘤（包括胃癌）中异常表达，对肿瘤的诊断和预后具有潜在价值。
lncRNA和miRNA的相互作用在肿瘤的发生发展中起了重要的调节作用。2011年，Salmena提出竞争性内源性RNA（competitive endogenousRNA，ceRNA）假说，这个假说认为：lncRNA、mRNA或其他的RNA分子，可以作为天然mRNA“海绵”，通过共同的miRNA反应元件(microRNA response elements，MREs)与miRNA结合从而影响miRNA导致的基因沉默。ceRNA假说揭示了一种RNA间相互作用的新机制。胃癌中lncRNA与miRNA或lncRNA与mRNA之间也存在着复杂的调控网络关系，这些调控网在胃癌的发生发展中起了重要的作用。对这些网络的深入研究，将有助于进一步了解胃癌的发病机制和演进过程。
癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)是由美国国家癌症研究所(NCI)和国家人类基因组研究所(NHGRI)建立的癌症测序数据库，收集了超过11000例包括33种肿瘤的癌症基因图谱，并且数据全部免费开放。随着基因组学和生物信息学技术的不断进步，lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络已经在多种肿瘤包括肺癌、肠癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌中得到构建，并且越来越多的具有ceRNA功能的lncRNA被研究发现，它们有望成为肿瘤诊断、治疗和预后的潜在靶点。
本研究中通过TCGA数据库和生物信息学技术构建胃癌lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络，进一步验证ceRNA网络中部分lncRNA的表达，并筛选出对胃癌细胞生物学功能影响最大的lncRNA_LINC00200作为研究对象，从体外细胞实验和体内动物模型探索和验证LINC00200调控胃癌生物学进程的潜在机制，以期为胃癌的诊断和治疗提供有价值的生物学靶标。
第一部分 基于TCGA数据库的胃癌相关长链非编码RAN差异表达谱及ceRNA调控网络的分析
目的：通过TCGA数据库和生物信息学技术，构建胃癌lncRNA-miRNA-mRNAceRNA网络，分析差异表达mRNA的作用通路，发现与胃癌患者预后相关的RNA分子。
方法：从TCGA数据库获取372例胃癌样本以及32例癌旁组织样本的RNA序列，通过“edgeR”软件分析得出胃癌差异表达lncRNA，miRNA和mRNA。用GO功能注释和KEGG通路分析得出差异表达mRNA的功能富集通路。用R语言中的生存软件分析差异表达RNA与患者预后的关系。
结果：根据差异表达倍数的10g2绝对值大于等于2且校正后P值小于0.01的标准，发现胃癌组织中有999个差异表达lncRNA，137个差异表达miRNA和1629个差异表达mRNA。GO功能注释发现差异表达mRNA主要富集在生物进程，细胞成分和分子功能上。KEGG通路分析显示差异表达mRNA参与了肿瘤相关通路的调控，如癌症转录失调，调节干细胞的信号通路，P53信号通路，PI3K-Akt信号通路。根据数据库预测和生物信息学技术分析，最终65个差异表达lncRNA，9个差异表达miRNA以及24个差异表达mRNA参与构建ceRNA调控网络。在ceRNA调控网络中，9个lncRNA与患者总生存相关（P＜0.05），6个mRNA与患者总生存相关(P＜0.05)。
结论：基于TCGA数据库大样本胃癌标本数据分析，得出胃癌差异表达RNA谱，构建胃癌lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网。这个网络精确而复杂地展示了RNA分子间相互调控的新机制，对研究胃癌的发生发展具有重要意义。
第二部分 胃癌中差异表达lncRNA的体外验证及功能研究
目的:为了验证TCGA数据库和生物信息学分析结果的准确性和可靠性，随机选择ceRNA调控网络中不同差异表达倍数的5个lncRNA进行体外细胞验证和初步功能探索。
方法:随机选取ceRNA网络中5个差异表达lncRNA，Real-time PCR检测5个lncRNA在正常胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞株SGC-7901中的差异表达。用siRNA干扰lncRNA表达，CCK8，Transwell以及细胞划痕实验分别检测干扰前后lncRNA对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。
结果:随机选取的5个lncRNA中，4个lncRNA (ERVMER61、DSCR4-IT1、HULC、LINC00200)在SGC-7901细胞中表达明显高于GES-1，与TCGA数据库预测结果一致。采用siRNA干扰后，SGC-7901胃癌细胞中5个lncRNA的表达显著降低。CCK8实验和Transwell侵袭实验发现ERVMER61、DSCR4-IT1、HULC、LINC00200敲减后SGC-7901细胞增殖和侵袭能力受到抑制。划痕实验结果显示两个lncRNA(HULC、LINC00200)敲减后，SGC-7901细胞的迁移能力显著降低。
结论:根据生物信息学技术分析和严谨的实验，TCGA数据库可以有效地为我们提供有价值的生物学靶标。LINC00200作为影响胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的生物学标志物，值得我们进一步深入研究。
第三部分 LINC00200对胃癌细胞生物学功能的影响及其机制研究
目的:lncRNA在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，本部分研究探讨LINC00200在胃癌中的生物学功能及影响胃癌细胞生物学行为的机制。
方法:qRT-PCR检测LINC00200在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达。CCK8、Transwell侵袭以及细胞划痕实验检测干扰LINC00200表达对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。通过荧光素酶实验确定LINC00200与miR-143-3p以及miR-143-3p与SERPINE1的调控关系及结合位点。通过补救实验确定LINC00200调控miR-143-3p/SERPINE1通路影响胃癌的进展。
结果:LINC00200在胃癌组织和胃癌细胞株中显著高表达。敲低LINC00200的表达体外抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。机制研究表明，LINC00200作为ceRNA，通过miR-143-3p间接调控靶基因SERPINEl的表达，从而影响胃癌的生物学进程。
结论:LINC00200在胃癌中高表达，通过影响miR-143-3p/SERPINE1通路促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。LINC00200有望成为胃癌潜在的诊断和治疗靶标。
第四部分 LINC00200体内调控SERPINE1表达影响胃癌的生长
目的:体内实验评估LINC00200调控SERPINE1表达对胃癌生长的影响。
方法:将LINC00200稳定下调和SERPINE1稳定过表达的SGC-7901细胞，分别或同时接种于荷瘤小鼠皮下构建成瘤模型，观察小鼠皮下肿瘤的体积和称取肿瘤重量。
结果:LINC00200下调组的SGC-7901细胞，对荷瘤小鼠体内的肿瘤形成能力明显低于空白对照组;SERPINE1过表达组在荷瘤小鼠体内的肿瘤形成能力高于空白对照组。过表达SERPINE1可以逆转LINC00200下调导致的成瘤能力降低。
结论:LINC00200通过调控SERPINE1表达体内促进胃癌细胞的生长和肿瘤形成。