论文部分内容阅读
农作物的生长、产量与品质受环境中存在的许多不利因素的严重影响。面对这些挑战,植物进化出许多适应机制。作为植物体中较大的一类转录因子家族,NAC转录因子在植物体的生长发育、生物及非生物胁迫响应过程中发挥了重要作用。虽然油菜是一种十分重要的油料作物,但是目前关于油菜中NAC转录因子家族成员的功能了解还很少。在本文中,我们对油菜中的两个NAC转录因子基因在活性氧(ROS)累积及细胞死亡过程中的功能与调控机制进行了初步研究。首先,我们从油菜中分离并克隆了BnaNAC56及BnaNACa基因,并发现BnaNAC56的表达受多种胁迫的诱导,如脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、百草枯(methyl viologen,MV)以及腐生型真菌病原体核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)等;相反,BnaNAC56的表达受到冷害胁迫的诱导。亚细胞定位及双荧光素酶报告系统检测表明BnaNAC56定位于细胞核内而且是一个转录激活子。烟草叶片中瞬时表达BnaNAC56基因以后,发现其能够引起ROS累积以及类似超敏反应的细胞死亡现象。随后我们进行了二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)染色并测定了一系列与ROS及细胞死亡相关的生理指标,如相对电导率、丙二醛、叶绿素以及H2O2等,这些结果均表明烟草叶片中出现ROS累积及细胞死亡现象。同时,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP粘性末端标记法(TUNEL)以及DNA梯型分析试验也表明BnaNAC56的表达诱导DNA片段化。此外,免疫印迹(Western blot)检测发现BnaNAC56以及对照GFP确实在烟草叶片中表达,说明烟草叶片出现的类似超敏反应的细胞死亡确实由BnaNAC56蛋白诱发。为了进一步确定BnaNAC56的功能,我们分离并制备了油菜原生质体,并利用PEG4000介导的方式分别转染BnaNAC56及GUS瞬时表达质粒,试验结果发现,与对照GUS相比,表达BanNAC56的油菜原生质体确实能够诱导ROS的累积以及细胞死亡。我们还进行了实时荧光定量qRT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)试验,检测了与ROS、细胞死亡、防御反应相关的一些标志基因的表达,发现某些标志基因的表达水平被显著诱导,而且双荧光素酶报告系统(Dual-LUC assay)也表明这些被诱导表达的标志基因确实能够被BnaNAC56激活。以上结果表明,BnaNAC56能够作为一个胁迫响应的转录激活子发挥功能并且在ROS累积及细胞死亡调控过程中起到十分重要的作用。类似地,我们开展了有关BnaNACa的功能研究。首先,我们将其在烟草叶片中瞬时过表达,发现烟草叶片中出现与BnaNAC56类似的现象,即ROS累积和类似超敏反应的细胞死亡。DAB染色结果显示烟草叶片表达BnaNACa的部位出现了明显的H2O2累积,而且H2O2含量的测定结果也显示随着BnaNACa表达时间的延长,H2O2的含量不断增加。此外,叶绿素、丙二醛、花青素含量以及相对电导率的测定结果均表明烟草中瞬时表达BnaNACa确实能够引起类似超敏反应的细胞死亡现象。但是BnaNACa在这一过程中的具体调控机制还不清楚,仍需进一步的深入研究。本研究首次鉴定了油菜中两个尚未报道的NAC转录因子基因的功能,为全面解析调控机制等指明了方向。