肝癌,尤其是肝细胞型肝癌是一种常见的恶性肿瘤,发现晚且死亡率高,因此及时发现、尽早治疗具有重要的临床意义。而生物标志物可作为早期临床诊断的工具,可显著提高患者的生存率。当前,临床常用的肝细胞型肝癌的血清早期诊断标志物主要有甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白异质体(AFP-L3)等,但这些检测指标的灵敏度和特异性均有待提高。而外泌体是一种与肿瘤的发生、发展密切相关的分泌型囊泡。已有报道显示,许多肿瘤中均可分泌包含特异的、可做潜在生物标志物的外泌体,因此,利用外泌体寻找生物标志物是目前研究的热点。本课题从肿瘤细胞分泌的外泌体(exosome)的蛋白质组学入手,期望通过临床样本的筛查,找到在肝癌病人血清中特异性高表达的生物标志物,以便开发肝细胞型肝癌的早期诊断试剂盒。本课题的研究成果分为以下三个部分:第一部分:成功从肝细胞型肝癌病人的新鲜组织中分离肿瘤组织及非肿瘤组织的原代细胞。收集这些原代细胞的培养上清液,分别运用差速离心法分离纯化外泌体。外泌体的鉴定结果显示,我们得到了形态完整,粒径分布正常的外泌体。运用FASP法处理所得的外泌体,并对其进行蛋白质组学分析。结果显示,我们提取的囊泡含有外泌体标志物,进一步证明其具备外泌体特征。与非肝癌组织外泌体相比,我们还找到在肿瘤外泌体中显著高表达的一组蛋白。第二部分:在非肿瘤组织和肿瘤组织中,运用RT-qPCR法对蛋白质组学的结果进行初筛,选出了两个在非肿瘤组织和肿瘤组织中mRNA表达水平具有差异的基因——PPP1CA和CAMSAP2。而后,运用蛋白质免疫印迹法和免疫组化法验证,发现与非肿瘤组织相比,PPP1CA在肿瘤组织中的蛋白表达水平显著升高。第三部分:运用ELISA法检测了 PPP1CA在肝癌患者和正常人的血清中的含量,发现PPP1CA在肝癌患者血清中含量显著升高。统计得出PPP1CA的检出率高达90.59%,且对比了传统肝癌标志物的检出情况,显示PPP1CA在诊断肝癌的灵敏度和特异性方面具有明显的优势。综上所述,本课题成功构建了一个以外泌体为手段的肝癌生物标志物研究系统,同时收集整理了一定量的肝癌临床样本,基于该系统和样本的统计分析,我们取得以下主要结果:1)找到了在肝癌组织样本中高表达的基因,为进行更为深入的生物学功能研究奠定了基础;2)筛选出了在肝癌患者血清样本中高表达的蛋白,分析得出其具有重要的临床意义,可作为肝癌临床诊断试剂盒开发的候选生物标志物。本项研究证明,利用外泌体研究系统并结合临床数据分析,可作为新型生物标志物和药物作用靶点发现的有效途径。