植绥螨是一类具有捕食能力的螨类,利用植绥螨控制农业害虫害螨是有害生物绿色防控的一项重要措施。在农业生态系统中,多数农业害螨,如二斑叶螨Tetranychus urticae、柑橘全爪螨Panonychus citri、山楂叶螨T.viennensis等为高温活动型叶螨,适度高温环境会加重该类型叶螨的发生与危害,而植绥螨对高温环境相对敏感,且商业化植绥螨大多是在25°C恒温条件下饲养获得。我国长江中下游和西南、华南地区,夏季6-8月日均温高于30°C的高温天数可能持续十几天甚至数十天,商业化植绥螨释放到田间后,即使在猎物相当充足的状况下,植绥螨种群数量仍增长较慢而失去对害螨的控制作用。同时全球气候变暖、极端天气频繁发生也是制约植绥螨在农业生态系统中持续控制害螨、发挥其生物防治效能的重要因素。因此,如何提高商业化植绥螨天敌产品的耐热性,使其在高温环境下仍具有高效、持续控制害虫害螨潜能,已成为当前利用植绥螨进行生物防治时最需要迫切解决的科技问题。巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri Hughes(Acari:Phytoseiidae)作为我国唯一已商业化生产的本土植绥螨种类,近年来在农业害虫害螨绿色防控中发挥了重要作用。然而,巴氏新小绥螨N.barkeri商业化品系由于长期饲养在最适温度环境中,释放到田间后因适应性差,使得控害效能严重缩水。因此,巴氏新小绥螨N.barkeri商业化品系抗逆性有待进一步加强。本学位论文以巴氏新小绥螨N.barkeri为研究对象,通过长期高温驯化(中等高温:35°C)与高温锻炼(45°C暴露2 h),筛选获得了巴氏新小绥螨N.barkeri高温品系,并对其生物生态学、生理学以及分子生物学的适应机理进行了评价,为高温环境下高效利用该螨控制靶标害虫害螨提供了理论依据与实践基础。通过近4年的研究,取得了如下研究结果:1高温胁迫对巴氏新小绥螨生物生态学的影响1.1巴氏新小绥螨常温品系与高温品系的建立商业化植绥螨多系为最适温区饲养、繁殖与规模化生产。本学位论文将恒温25°C环境中饲养的巴氏新小绥螨N.barkeri实验种群视为常温品系(conventional strain,CS),该品系亦可被视为商业化品系(commercial strain,CS)。为筛选获得巴氏新小绥螨N.barkeri高温品系(high temperature adapted strain,HTAS),本学位论文设定了“高温锻炼—高温驯化—高温再锻炼—高温再驯化”的长期筛选模式。巴氏新小绥螨N.barkeri长期高温驯化饲养温度为35°C;高温锻炼过程,即每驯化饲养15-20 d后于45°C暴露1次,每次暴露约2-4 h。截止到本学位论文开展试验测定生物生态学、生理学以及分子生物学等适应性评价时,巴氏新小绥螨N.barkeri共获得高温锻炼次数至少为25次,高温驯化天数近450 d(约110代左右)。1.2巴氏新小绥螨高温敏感性测定巴氏新小绥螨N.barkeri经过长期高温驯化和高温锻炼,对短时高温胁迫的承受能力显著增强。因卵壳的保护作用,巴氏新小绥螨N.barkeri卵有较强的高温耐受能力,常温品系和高温品系卵在经历短时高温胁迫后,其孵化率差异不显著;两种品系雌成螨高温致死率均随胁迫强度的增加(温度和暴露时间)而显著升高,但高温品系在极端温度环境中的存活时间显著长于常温品系(如45°C时:HTAS LT50=15.2 h远远长于CS LT50=1.9 h)。户外高温热浪暴露8 h后,高温品系雌成螨死亡率亦低于常温品系雌成螨死亡率。1.3中等高温环境中(35°C vs 25°C)巴氏新小绥螨的生殖与存活策略巴氏新小绥螨N.barkeri具有非常明显的温度可塑性和适应性。常温品系在35°C环境中能够正常生长发育、交配和繁殖,但其适合度相比室温25°C环境明显降低,主要表现为发育加快(1.63 d,占27.0%)、总产卵量降低(42.5粒/雌,占64.0%)和平均寿命缩短(29.7 d,占57.2%),且未成熟期死亡率增大(27.0%,占29.3%)。高温品系无论是在室温25°C还是在高温35°C环境中,其发育速率均变快;25°C时,总产卵量和平均寿命与常温品系无显著差异,暗示着巴氏新小绥螨N.barkeri高温品系在室温环境中亦能发挥较大生殖潜能,但在高温35°C环境中,总产卵量显著低于常温品系,说明高温品系中存在明显的生殖与存活权衡机制。此外,长期高温饲养还可导致雌性比例降低(15.1%,占21.0%)。总体来讲,巴氏新小绥螨N.barkeri在中等高温环境中主要是以降低繁殖水平来换取存活空间。1.4短时高温胁迫对巴氏新小绥螨繁殖的影响根据高温敏感性测定结果,在实验室内模拟了短时高温事件(分别在38°C和42°C处理了2 h和4 h,以室温25°C未经胁迫处理为对照),分批次对巴氏新小绥螨N.barkeri雌成螨(羽化后1-2 d)进行了高温处理,并对其存活情况和生殖特性予以评价(允许雌成螨与同龄雄成螨(未经胁迫处理)进行多次交配以获得最大产卵量)。结果表明,巴氏新小绥螨N.barkeri常温品系雌成螨经过短时高温胁迫处理后,产卵前期显著延长、总产卵量显著下降、平均寿命显著缩短,且随胁迫强度的增加而变得愈加明显;高温品系雌成螨产卵前期亦延长,总产卵量降低,但雌成螨平均寿命并未受到影响,且在42°C胁迫处理组中(2 h和4 h),高温品系雌成螨平均寿命显著长于常温品系平均寿命。考虑到巴氏新小绥螨N.barkeri属两性生殖方式(或假产雄孤雌生殖方式),本论文以常温品系为研究对象,分别阐明了雌成螨、雄成螨分别遭遇高温胁迫以及同时遭遇高温胁迫后,雌雄成螨的交配行为(仅允许交配1次),各自平均寿命、总产卵量等是否受到高温胁迫效应的影响,以及子代卵孵化水平即是否受到亲代高温胁迫的影响。结果表明雄性个体在种群增长过程中扮演重要角色,短时高温胁迫亦能使雄性个体与雌性个体交配时间显著延长;雌雄成螨分别遭遇、特别是同时遭遇高温胁迫后,雌性个体产卵前期显著延长,总产卵量显著下降,但子代卵的孵化率并未受到亲代效应影响。综合分析认为,高温胁迫对巴氏新小绥螨N.barkeri繁殖特性具有一定程度的负面影响,这可能是夏季高温时段导致其种群退化的重要因素。1.5高温胁迫对巴氏新小绥螨捕食功能反应的影响为明确巴氏新小绥螨N.barkeri对二斑叶螨T.urticae潜在控制能力是否受高温胁迫效应的影响,试验共设置2个胁迫温度处理(38°C和42°C,以25°C为对照)和2个胁迫时间处理(2 h和4 h),分别对两种品系雌成螨事先进行高温胁迫处理,在室温(25°C)环境中研究了巴氏新小绥螨N.barkeri雌成螨对二斑叶螨T.urticae若螨的捕食功能反应。无论巴氏新小绥螨N.barkeri经历高温胁迫与否,两种品系雌成螨对二斑叶螨T.urticae若螨捕食功能反应均为Holling II型。高温胁迫后,常温品系雌成螨对二斑叶螨T.urticae若螨捕食量(24 h)与对照相比呈现下降趋势,瞬时攻击率(a)降低,处理时间(Th)延长,对猎物控制能力(a/Th)降低,但均未随胁迫强度而呈现规律性变化。高温品系雌成螨对二斑叶螨T.urticae若螨的捕食功能反应并不受高温胁迫的影响。高温胁迫可能对巴氏新小绥螨N.barkeri食欲产生负面影响,短期内出现厌食反应,但随室温恢复时间的延长其捕食功能可能会逐渐得到恢复。2巴氏新小绥螨抗氧化反应研究温度胁迫能够打破巴氏新小绥螨N.barkeri细胞内氧化还原平衡,发生氧化胁迫。雌成螨在低温0°C和5°C、高温38°C和42°C环境中分别胁迫2 h和4 h,以25°C为对照,测定了巴氏新小绥螨N.barkeri两种温度品系雌成螨的抗氧化反应水平。研究结果表明,高温品系雌成螨细胞内超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽-硫-转移酶GSTs和总抗氧化能力T-AOC活性均显著低于常温品系,脂质过氧化水平亦低于后者,说明抗氧化酶系统可能参与了巴氏新小绥螨N.barkeri高温驯化反应。当遭遇高温胁迫后,两种品系SOD、CAT、POD以及GSTs活性均显著增强,暗示着这些抗氧化酶可能以一种协同作用的方式共同参与细胞内抗氧化过程;随胁迫强度的增加,如42°C处理4 h后,雌成螨体内MDA含量升高且达到最大值,暗示了抗氧化酶系统清除活性氧ROS能力有限,导致体内脂质过氧化程度较高,甚至引起个体死亡。低温胁迫(0°C)能诱导SOD等4种抗氧化酶活性上调表达,以维持细胞内氧化还原平衡,但MDA含量仅在高温品系雌成螨体内累积,说明高温品系可能对低温胁迫较为敏感,脂质过氧化程度较高。综合分析表明,巴氏新小绥螨N.barkeri在高温驯化过程中可能会尽量选择降低能量消耗,通过协同多种抗氧化酶以应对温度胁迫。3巴氏新小绥螨两种品系转录组数据比较与分析本章基于Illumina Hi Seq?2000平台对巴氏新小绥螨N.barkeri常温品系和高温品系两个样本进行全螨态转录组测序,分别获得42,917,214和43,537,230个clean reads,经过组装后获得52,776条Unigenes,分别在nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库中进行了比对注释,共有36,951条Unigenes在上述5个数据库得到注释,注释率为70%。通过对nr数据库中成功注释的Unigene同源性分析,发现有52.9%的基因与其近缘物种西方盲走螨Metaseialus occdentalis相似。巴氏新小绥螨N.barkeri经过高温驯化,其基因表达量在转录水平上实现了新的重组,有多达10506条Unigenes表达量发生显著性变化,约占总数的1/5,其中有6,338条Unigenes上调,4,168条Unigenes下调,说明高温环境中基因表达发生了适应性改变,相当多的基因显著上调/下调表达。4巴氏新小绥螨热激蛋白HSPs mRNA表达模式解析从巴氏新小绥螨N.barkeri转录组数据库中找到了5条与热激蛋白基因相关的HSPs Unigenes,分别是CL1558.Contig1_All、Unigene13225_All、CL4607.Contig1_All、Unigene8871_All、Unigene861_All,通过Blastn序列比对,最终确定目的基因序列分别为Hsp90、Hsp75、Hsp70、Hsp60和Hsp40。使用在线引物设计软件Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3/),设计以上5个HSPs基因的RT-qPCR引物,以Beta actin基因作为参考基因。采用RT-qPCR技术,首先明确了巴氏新小绥螨N.barkeri 5种HSPs基因在不同发育阶段中的m RNA表达模式。结果发现,常温品系与高温品系HSPs m RNA相对表达量均在各自不同发育阶段中均存在显著性差异。Hsp90 m RNA在常温品系卵期和成螨阶段表达量较高,但在高温品系若螨和雌成螨体内表达量较高;Hsp75 m RNA分别在常温品系雌成螨和高温品系若螨体内表达量较高;Hsp60 m RNA在常温品系若螨及成螨体内表达量较低,而在高温品系卵和雄成螨体内表达量较低。热激蛋白HSPs(Hsp90 m RNA和Hsp60 m RNA)在高温品系中发生差异性表达(相较于常温品系),暗示了这些HSPs蛋白在高温品系驯化饲养过程中可能发挥了重要的生理功能。Hsp70和Hsp40作为生物体内最为重要分子伴侣蛋白,其表达量在两种品系中均随发育阶段而呈现显著上调表达趋势。其次明确了高温胁迫温度(分别在38°C和42°C中处理1 h)对巴氏新小绥螨N.barkeri两种品系5种HSPs m RNA表达模式的影响。结果发现,高温胁迫能诱导巴氏新小绥螨N.barkeri Hsp90 m RNA、Hsp75 m RNA、Hsp70 m RNA、Hsp60 m RNA和Hsp40 m RNA在各发育阶段内的上调表达,其表达模式具有明显的温度效应,即在42°C中暴露1 h时上调表达倍数最为显著,例如常温品系Hsp70 m RNA在卵、幼螨、若螨、雄成螨和雌成螨中上调倍数分别达1258.6倍、2443.9倍、269.4倍、135.2倍和42.9倍,高温品系Hsp70 m RNA在卵、幼螨、若螨、雄成螨和雌成螨中上调倍数分别达1739.2倍、1478.9倍、215.5倍、159.9倍和45.9倍。最后明确了高温胁迫时间(42°C中处理1 h、2 h、3 h和4h)对巴氏新小绥螨N.barkeri雌成螨5种HSPs m RNA相对表达量的影响。结果表明,常温品系Hsp70 m RNA和Hsp40 m RNA在胁迫1 h后表达量显著上调表达,且随胁迫时间的延长逐步恢复至正常水平/略高于正常水平;当胁迫时间大于等于3 h时,高温品系雌成螨Hsp70m RNA和Hsp40 m RNA表达量显著高于常温品系,说明Hsp70和Hsp40蛋白在高温品系抵御高温中起到保护作用。巴氏新小绥螨N.barkeri雌成螨Hsp90 m RNA和Hsp60 m RNA在高温胁迫模式中的表达也遵循时间效应。综合分析表明,巴氏新小绥螨N.barkeri HSPs在高温驯化反应和应激胁迫过程中发挥着重要作用。综上所述,本学位论文紧密围绕植绥螨商业化品系“田间适应能力差、控害效能低”这一突出科技问题,以巴氏新小绥螨N.barkeri为试验材料,在通过长期高温锻炼与高温驯化等方式筛选获得其高温品系基础上,系统开展了巴氏新小绥螨N.barkeri高温适应性机制的相关研究。在生物生态学方面,通过模拟高温胁迫事件,发现巴氏新小绥螨N.barkeri高温品系对高温胁迫敏感程度显著降低;高温品系雌成螨个体存活、总产卵量、平均寿命以及取食量均受高温胁迫效应影响较常温品系小;高温胁迫还可导致雄成螨生殖力降低。在生理层面,温度胁迫能够打破巴氏新小绥螨N.barkeri细胞内氧化还原平衡,造成氧化胁迫;抗氧化酶系统参与了巴氏新小绥螨N.barkeri高温驯化反应及其氧化应激过程,抵御短时高温胁迫。在分子层面,构建了巴氏新小绥螨N.barkeri常温品系与高温品系转录组数据库,研究结果为后期进一步揭示其高温适应机制提供重要依据;热激蛋白HSPs在高温驯化和应激胁迫过程中发挥着重要作用。研究结果从多个层面证实,高温驯化反应提高了巴氏新小绥螨N.barkeri常温品系高温耐受水平,其高温品系将为高温活动型农业害螨持续防控难题奠定重要理论和实践基础。