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1研究背景肝郁脾虚证是中医常见证候,可见于临床多种疾病,所涉及疾病病种达40多个,包括肝胆疾病、肠道疾病、胃病等消化系统疾病及抑郁症等精神类疾病等。逍遥散是治疗肝郁脾虚证的经典方剂。然而,肝郁脾虚证的生物学基础目前尚不清楚,逍遥散治疗该证候的治疗机制亦不完全清楚。应激是机体在面对各种刺激时所表现的全身性非特异性适应反应。这种反应具有其过程性和阶段性,与肝郁脾虚证的形成具有高度的相关性,因此可以通过病因造模法,采用慢性束缚应激的方法模拟肝郁脾虚证候的病因病机过程,来建立肝郁脾虚证候模型。目前,通过对肝郁脾虚证候动物模型的研究表明,该证候存在着机体广泛的病理生理改变,涉及机体多个系统,主要包括神经-内分泌系统、免疫系统、消化系统、脑肠轴、下丘脑-垂体-肾上腺／性腺／甲状腺轴等方面。突触在神经信息的传递中发挥着不可或缺的作用。神经元可以产生突起或形成突触连接,而且突触等细微结构可以因为各种因素进行不同的修饰,这便是神经系统突触可塑性。研究表明应激反应可以导致神经系统,尤其是海马的突触可塑性改变,影响学习记忆、大脑结构和多种生理过程等发生变化。N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-Methyl-D-Aspartate Rcceptor, NMDAR)、钙调蛋白激酶、Kalirin、Rac等蛋白或神经受体都与神经突触可塑性的改变密切相关。2007年,有学者首次提出NMDAR/CaMK Ⅱ/Kalirin/Rac信号通路,该通路的激活可以导致神经中现存的树突棘(spines)快速扩大,从而起到突触可塑性的作用。因此,可以利用慢性应激的方法复制肝郁脾虚证候模型,以NMDAR/CaMK Ⅱ /Kalirin/Rac信号通路为切入点,从突触可塑性方面来研究肝郁脾虚证的生物学基础及逍遥散的治疗机制。2实验目的(1)观察肝郁脾虚证大鼠海马NMDAR/CaMK Ⅱ/Kalirin/Rac通路的改变,以期探讨肝郁脾虚证发生的分子生物学机制,探索肝郁脾虚证候与神经突触可塑性改变的关系。(2)探索逍遥散抗肝郁脾虚证的作用机制,为中医肝郁脾虚证及中医临床防治应激性抑郁疾病提供实验依据。3实验方法本实验主要由四部分组成。第一部分首先通过21天慢性束缚应激制作大鼠模型,并通过逍遥散作为干预药物,以氟西汀作为阳性对照,从动物宏观表征,饮食体重变化,旷场试验,新环境抑制进食实验,蔗糖消耗实验,以及逍遥散的反证作用,来证实所造模型为肝郁脾虚动物模型。实验第二、三部分在确认模型成功的基础上,通过分子生物学技术,采用RT-PCR,Western blot等方法,观察肝郁脾虚模型大鼠海马NMDAR/CaMKⅡ/Kalirin/Rac通路的改变,并研究逍遥散对该模型相关改变的调节作用,以研究逍遥散对模型大鼠海马突触可塑性改变的调节作用。实验第四部分采用ELISA的方法,观察突触相关的蛋白表达情况,从侧面印证逍遥散对肝郁脾虚模型大鼠海马突触可塑性改变的调节作用。4主要实验结果(1)通过21天慢性束缚应激,各组大鼠饮食量基本无明显变化,和正常组相比,模型组大鼠体重一直增长缓慢(P<0.01),氟西汀组和逍遥散组大鼠在实验第3周,体质量和模型组比较差异显著(P<0.05)；旷场实验表明模型组大鼠5分钟运动总距离和总穿格数均比正常组明显下降(P<0.05),逍遥散组、氟西汀组明显升高,和模型组比较差异显著(P<0.05)；糖水消耗实验提示模型组蔗糖水消耗率明显低于正常组(P<0.05),氟西汀组则明显高于模型组(P<0.05)。以上结果提示成功建立肝郁脾虚证候模型。(2) Western blot结果显示：和正常组相比,海马组织NR1、NR2B、CaMKⅡ、Rac蛋白表达均下降(P<0.05或P<0.01),经氟西汀治疗后,NR2B、CaMKⅡ、Rac蛋白表达水平升高(P<0.05),逍遥散治疗组NR2B、CaMKⅡ水平升高(P<0.05),和模型组比较差异有统计学意义。NR2A和Kalirin蛋白表达存在模型组降低的趋势,但各组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)实时荧光定量PCR结果显示：和正常组相比,海马组织模型组NR2B、CaMKⅡα、 Kalirin基因表达水平降低(P<0.05),经氟西汀治疗后,CaMKⅡα、Kalirin基因表达水平升高(P<0.05),逍遥散治疗组NR2B、CaMKⅡα基因表达水平升高,和模型组比较差异有统计学意义。NR2A和Rac1基因表达水平在各组差异无统计学意义(P>0.05)。(4)ELISA结果显示：和正常组相比,模型组海马SYP、MAP-2含量明显降低(P<0.05),Nogo-A和F-actin含量升高(P<0.05)；经氟西汀治疗后,MAP-2含量升高,Nogo-A和F-actin含量降低(P<0.05),逍遥散治疗组SYP含量升高(P<0.05), Nogo-A和F-actin含量降低(P<0.05),差异有统计学意义。GAP-43模型组有降低趋势,但各方组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。5实验结论(1)通过对大鼠进行21天慢性束缚应激的方法可以成功复制出肝郁脾虚证候模型。(2)造模可以引起大鼠海马NMDAR/CaMK Ⅱ/Kalirin/Rac1通路各分子蛋白和基因表达的下降,提示应激抑制了改信号通路的转导。(3)造模可以引起大鼠海马突触改变相关因子SYP、MAP-2、Nogo-A、GAP-43、 F-actin的上调或下调,提示应激可能造成大鼠海马突触发生变化。(4)逍遥散混悬液可上调肝郁脾虚证后大鼠海马NMDAR/CaMK Ⅱ/Kalirin/Racl通路中多数分子蛋白及基因表达,同时可改变突触相关蛋白如骨架蛋白F-actin等,引起突触结构的改变,进一步可能影响其功能改变。这很可能是逍遥散发挥其治疗作用的机制之一。