脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3)是一类催化脂肪酸甘油酯水解的酶类，它作为生物催化剂的重要组成部分有着广泛的用途。米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶具有良好的1，3位置专一性，它能催化甘油三酯产生脂肪酸和单甘酯，单甘酯是一种重要的非离子型表面活性剂，已广泛地应用于食品、乳制品和化妆品等行业。因此，利用基因手段，构建产酶活力高的基因工程菌对生产单甘酯等具有重要的意义，是当前研究的热点，另外，脂肪酶活力至今仍然没有统一的测定方法，如何准确测定酶活力大小，对研究脂肪酶的特性及应用具有重要意义。本论文利用本实验室保存的含米根霉(Rhizopus oryzae 3．2686)脂肪酶基因ROL的重组质粒pGMT-ROL，设计两对特异性引物定向克隆甘油三酰酯脂肪酶基因ROL，分别与与载体pET-28a和pET-11c连接，构建成表达重组载体pET-28a-ROL和pET-11c-ROL。采用氯化钙法，将重组表达载体分别转入受体菌组BL21(DE3)和Origami DE3中，分别通过Kana抗性平板和Amp抗性平板筛选初步筛选获得阳性克隆。通过菌落PCR和提取重组质粒做筛选，筛选到的重组子，用IPTG做诱导基因表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，可鉴定重组菌表达了重组蛋白，约35KD。另外，本文比较和改进了酸碱滴定法，对硝基苯酚比色法和铜皂法三种常用的脂肪酶活力测定方法。具体比较了其所耗时间，测出酶活大小的准确性，灵敏度。为对硝基苯酚比色法找到了有效的方法来终止反应，改进的对硝基苯酚比色法具有重复性好的特点。另外还对其中的铜皂法进行了改进，用甲苯代替了苯，取得了较好的结果，改进的铜皂法具有毒性小、快捷的优点。通过对几种测定方法的比较改进和优缺点的讨论，为以后测定脂肪酶活力提供选择依据。