本论文主要研制了几种基于G-四倍体和三臂交联结构的新型DNA生物传感器，并将其应用在金属铽离子、口腔癌相关基因短片段和凝血酶蛋白的高灵敏高特异性检测。本论文分为六章。第一章：绪论。本章详细介绍了DNA结构的多样性、特点和研究进展。着重介绍基于DNA结构多样性及构型变化的生物传感设计，包括不同结构类型的DNA探针（特别是G-四倍体和三臂交联结构探针）及其在金属离子、药物小分子、蛋白、杂交检测技术和基因诊断方法研究中的应用（包括间接检测和直接检测技术，特别是基于电化学技术的检测方法）。最后阐述本文的研究目的及主要内容。第二章：基于G-四倍体的非标记型电化学生物传感器用于超痕量铽离子的检测。本章研制一种基于“G-四倍体”和“交流阻抗技术”的“非标记型”DNA电化学生物传感器，并将其用于Tb³⁺的高灵敏、高特异性检测。该传感器的工作原理如下：首先，根据人体端粒DNA的特点，设计一种富含鸟嘌呤（G碱基）的单链DNA序列，并将该序列末端进行巯基修饰，通过Au-S键将其固定在金电极表面以作为探针。然后用巯基己醇（MCH）对金电极表面进行封闭处理，以形成探针DNA和巯基己醇的混合组装层。由于MCH的竞争和取代作用，使大部分呈自由单链状态的探针DNA以直立的构型组装在电极表面上。因此，将该电极浸入到铁氰化钾（K₄Fe（CN）₆）溶液中时，负电性的[Fe（CN）₆]^3-/4-就会渗透到电极表面进行电子传递，此时，电极表面的电阻（Ret）较小。将Tb³⁺加入铁氰化钾（K₄Fe（CN）₆）溶液中时，富含G碱基的探针DNA即在Tb³⁺的诱导下，弯曲折叠成稳定的“G-四倍体”（G-quadruplex）结构。该结构的空间立体效应明显阻碍了[Fe（CN）₆]^3-/4-到达电极表面发生氧化还原反应，所以Ret增大。通过应用“交流阻抗技术”检测Tb³⁺加入前后Ret的变化，即可实现对Tb³⁺的高灵敏、非标记型检测。同时，由于G-四倍体对痕量Tb³⁺的高特异性识别能力，使得该传感器具有较高的选择性。第三章：基于铽离子诱导脱氧核酶的非标记型生物传感器用于铽离子的可视化检测。本章研制了一种基于铽诱导脱氧核酶的非标记型生物传感器，并将其用于铽离子(Tb³⁺)的可视化检测。首先，设计了一种富含鸟嘌呤（G碱基）的单链DNA序列（AG4），当Tb³⁺不存在时，AG4呈自由单链状态。一旦加入Tb³⁺，AG4即在Tb³⁺的诱导下弯曲折叠成“G-四倍体”（G-quadruplex）结构，并结合氯化血红素（hemin）形成脱氧核酶（DNAzymes）。该酶具有类似辣根过氧化酶（HRP）的活性，可以催化过氧化氢（H2O2）氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的反应，并产生最大吸收波长分别为370nm和653nm的蓝色产物。因此，通过目视法或者分光光度法即可实现对微量Tb³⁺的检测。与目前广泛应用的钾诱导脱氧核酶相比，铽诱导的脱氧核酶表现出更强的辣根过氧化酶催化活性，且Tb³⁺可在更低浓度下诱导DNAzyme的形成。该传感器制作容易、操作简单、检测快速，具有很好的稳定性和重现性，并能较好地抵抗钠、钾等金属离子的干扰，有望用于海水中超低含量Tb³⁺的检测。第四章：基于三臂交联探针的非标记型DNA电化学生物传感器的研制。本章研制了一种基于三臂交联探针的新型DNA电化学生物传感器，并将其用于特定基因序列的高灵敏、高特异性检测。三臂交联探针技术是建立在“模板增强杂交过程”（Template-enhanced Hybridization Processes，TeHyP）概念上的。首先，根据这一概念和目标序列（T）的特点，设计了两条与T部分互补的DNA探针，其中一条为捕获探针（CP），通过其5′端修饰的巯基，以Au-S键固定在金电极表面；另一条为辅助探针（AP）。在特定的温度下，当目标序列不存在时，两条部分互补的DNA探针因解链温度低而不杂交。此时，电极表面只有CP，通过其自身带负电荷的磷酸骨架静电吸附的电活性物质[Ru（NH₃）₆]³⁺（RuHex）较少，因此产生的电流信号较小。但当目标序列存在时，CP、AP和T即可相互杂交并形成稳定的“Y”型三臂交联结构。该结构的形成使得电极表面的DNA序列增多，吸附的RuHex也随着增多，因此，电流信号增强。通过采用电化学技术检测目标序列加入前后，RuHex的电流强度变化即可实现对目标DNA序列的检测。同时，三臂交联结构使得该传感器具有很好的单碱基错配识别能力。另外，传感器制作容易、操作简单、稳定性高、重现性好，经过简单处理即可重复使用。第五章：基于脱氧肌酐修饰三臂交联探针的电化学生物传感器用于口腔癌相关基因的检测与单核苷酸多态性分型。本章研制了一种基于脱氧肌酐（2’-deoxyinosine, dI）和“三臂交联探针”的电化学生物传感器，并实现了对唾液中口腔癌相关基因的检测与单核苷酸多态性（SNPs）的分型。首先，根据“三臂交联探针”的特点，设计了两条与口腔癌相关基因片段部分匹配的单链DNA探针，其中一条为dI修饰探针（DP），它是用dI替代了与SNPs位点相临的左右两个碱基的DNA序列，另一条为捕获探针（CP），通过5′端修饰的巯基，以Au-S键固定在金电极表面。在特定的温度下，当目标序列不存在时，这两条部分互补的单链DNA探针不会杂交。但当目标序列存在时，三者即相互杂交并形成稳定的“Y”型三臂交联结构，通过电化学技术检测[Ru（NH₃）₆]³⁺（RuHex）的电流强度变化实现对目标序列的检测。由于稳定的“Y”型三臂交联结构具有很强的SNPs识别能力，dI的引入更使这一能力大大增强，因此，该传感器对口腔癌相关基因片段的SNPs分型检测具体很高的灵敏度性与特异性。另外，该传感器制作容易、操作简单、具有很好的稳定性和重现性，有望用于实际样品的检测。第六章：基于三臂交联探针的核酸适体电致化学发光生物传感器用于超痕量凝血酶的检测。本章研制了一种基于三臂交联探针的核酸适体电致化学发光（ECL）生物传感器，并将其用于凝血酶蛋白（Thrombin）的高灵敏、高特异性检测。该传感器由ECL底物和ECL开关两部分组成。ECL底物的制备方法如下：将具有ECL活性的钌联吡啶(Ru（bpy）₃²⁺)掺杂在纳米金胶（AuNPs）中形成Ru（bpy）₃²⁺-AuNPs复合物，再将其组装在金电极表面构成一种固相ECL膜。ECL开关的制备方法如下：根据“三臂交联探针”的特点设计三条部分碱基序列匹配的单链DNA探针，其中一条作为捕获探针（CP），通过5′端修饰的巯基，以Au-S键固定在组装了纳米金胶的电极表面上；一条为核酸适体探针（AP），它含有能特异性识别凝血酶的核酸适体序列，可与凝血酶结合形成稳定的“G-四倍体”适配体复合物。另一条为信号探针（FP），3′端修饰电化学活性分子二茂铁基团（Fc）；当凝血酶不存在时，三条探针在电极表面相互杂交并形成稳定的“Y”型三臂交联体结构，此时，信号探针上标记的二茂铁基团紧靠电极表面，由于二茂铁能高效猝灭钌联吡啶的电致化学发光，导致修饰电极的电致化学发光强度较小。相反，当凝血酶存在时，它将与核酸适体探针结合形成更稳定的“G-四倍体”结构，从而导致三臂“Y”型交联结构解离，同时，标记有二茂铁基团的信号探针即被冲洗离开电极表面，钌联吡啶的电致发光信号大大增强。通过测定凝血酶加入前后修饰电极上Ru（bpy）₃²⁺的ECL信号差值（△IECL），实现对目标蛋白凝血酶的检测。