阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）即老年性痴呆，是一种发生在中枢神经系统中以认知、学习和记忆功能障碍为特征的原发性神经退行性疾病。AD的典型病理特征之一是脑内出现高密度的老年斑，老年斑的主要成份是由39～43个氨基酸组成的淀粉样β-蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）。目前，关于全长的Aβ分子如Aβ_1-40或Aβ_1-42的神经毒性作用，无论是离体还是在体实验，都已有广泛报道。人工合成的一个短的Aβ片段，Aβ_25-35，也被许多研究发现具有同全长Aβ分子相同的神经毒性作用。我们实验室先前的实验表明，Aβ_31-35，一个比Aβ_25-35更短的片段，也具有致大脑皮层细胞凋亡和伤害有关离子通道的作用。这些不同片段对神经细胞生存的效应提示，Aβ的神经毒性作用可能集中在其分子结构中的某些关键氨基酸序列之中。AD的另一个典型的病理特征是，基底前脑胆碱能神经元发生退行性变和继发的大脑皮层及海马胆碱能系统功能障碍。胆碱能受体包括毒蕈碱型和烟碱型两大类。有报道表明，相对于毒蕈碱型受体或其它受体而言，AD病人脑内更多的是烟碱受体水平的明显下降。烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）是一组多基因家族的配体门控离子通道，它参与脑内包括认知活动在内的多种功能调节。研究发现，Aβ_1-42在pmol和nmol的浓度范围内分别对α7和α4β2亚型烟碱受体具有高亲和力。因此，表达有α7和α4β2 nAChRs的神经元可能尤其脆弱，更容易受到Aβ的伤害。海马长时程增强（long-term potentiation，LTP）是由强直刺激作用于海马兴奋性突触的突触前传入通路后，在突触后神经元表现出的长时间突触传递效率增强的现象。作为突触传递可塑性的表现形式，海马LTP已被广泛作为研究学习和记忆的细胞模型。已有研究发现，全长的Aβ分子如Aβ_1-42及其活性片段Aβ_25-35能够压抑大鼠在体海马或离体海马脑片由高频刺激诱发的LTP。然而，Aβ_31-35片段是否也具有与Aβ_1-42或Aβ_25-35一样的牛物活性以及Aβ压抑LTP的机制仍然不清楚。尤其是，在Aβ引起的LTP压抑中，nAChRs是否发挥作用和如何发挥作用仍然是一个有争议的问题。虽然曾有报道，nAChRs激动剂可以诱导海马LTP，并且吸烟和AD呈负相关；但最近的研究发现，nAChRs亚型激动剂也可以在大鼠海马齿状回直接压抑LTP的诱导，并且有调查表明，相对于不吸烟者，吸烟者有更高的发生AD的危险性。另一方面，在海马脑片和培养的大鼠海马神经元上已经记录到不同类型的烟碱电流，这为研究AD时胆碱能系统功能活动的改变创造了条件。这些神经元上的nAChRs可以影响和调节突触传递的可塑性，其功能活动的改变至少可以部分地用以解释烟碱受体对学习和记忆的影响。但至今还没有在急性分离的海马神经元上看到有关nAChRs分布的报道，即使在其它方式获取的标本上，Aβ对nAChRs及其介导的电流的调制作用也仍有争议。同时，大量研究已经证明，钙离子(Ca²⁺)作为一种第二信使在调节细胞反应、影响神经系统的发育和突触可塑性活动中起关键作用。并且，细胞内Ca²⁺稳态的破坏程度，与某些神经退行性疾病的发生以及病理损伤程度密切相关。目前已经肯定，AD时由Aβ诱导的细胞内Ca²⁺浓度(intracellular calcium concentration，[Ca²⁺]_i)的异常增高即钙超载是Aβ发挥神经毒性作用的重要机制之一。然而，Aβ引起细胞内钙超载的机制还不完全清楚。鉴于神经元nAChRs对Aβ具有高的亲和力以及nAChRs本身对Ca²⁺有相对高的通透性，探讨nAChRs是否介导了Aβ引起的[Ca²⁺]_i升高，显然也是一个值得研究的问题。因此，在本研究中，我们进行了如下工作：（1）利用场电位记录手段，研究了三种不同的Aβ片段(Aβ_25-35、Aβ_31-35和Aβ_35-31)对在体海马LTP诱导的作用以及可能的nAChRs机制；（2）采用全细胞膜片钳技术观察了nAChRs是否在急性分离的海马CA1神经元上有功能性的表达，以及Aβ对nAChRs电流的调制作用；（3）使用荧光Ca²⁺成像技术研究了Aβ引起[Ca²⁺]_i，增加的nAChRs机制。除此之外，本研究在所有实验中，都观察了三种不同的Aβ片段的作用，通过对三者作用的比较，试图证实我们先前提出的假说，即Aβ_31-35可能是全长Aβ分子发挥神经毒性作用的更短的活性中心。第一部分：淀粉样β-蛋白对大鼠在体海马CA1区LTP的压抑作用及其nAChRs机制研究为研究不同的Aβ片段对大鼠在体海马CA1区LTP的作用及Aβ损伤LTP可能的nAChRs机制，本实验将麻醉大鼠固定在脑立体定位仪上，通过给予海马Schaffer侧枝单个电刺激、强直电刺激或双脉冲刺激，在海马CA1区诱发和记录基础的场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs）、强直刺激引起的fEPSPs的长时程增强即LTP以及配对脉冲引起的双脉冲易化（paired pulse facilitation，PPF）。经脑室套管向侧脑室内注射各种Aβ片段及nAChRs特异性激动剂或拮抗剂后，观察了各种药物对基础fEPSPs、LTP以及PPF的影响。结果显示：（1）侧脑室注射生理盐水（对照组）后，fEPSPs幅度保持稳定；给予高频刺激（high-frequency stimulus，HFS）后，fEPSPs幅度立即上升到205．1±10．0％，HFS后60min时依然保持在160．8±7．3％（n=7）。（2）侧脑室注射25 nmol Aβ_25-35、Aβ_31-35或Aβ_35-31，对基础突触传递没有影响；但Aβ_25-35和Aβ_31-35的预处理明显压抑了HFS引起的LTP诱导，在HFS后60 min时，LTP值分别为118．5±3．0％（n=7）和114．3±4．1％（n=8），与对照组相比，均有显著性差异（P<0．01）；给予Aβ_31-35的反序列Aβ_35-31后，与对照组相比，LTP的诱导没有明显变化，HFS后60 min时，fEPSPs幅度仍为155±3．9％（n=6，P>0．05）。（3）侧脑室注射0．01μg、0．05μg和0．5μg的α4β2亚型nAChRs特异性激动剂epibatidine后，fEPSPs幅度于HFS后60 min时，分别为129．7±4．4％（n=6），122．3±6．5％（n=7）和107．6±4．1％（n=6），显示了剂量依赖性压抑效应。（4）联合给予0．05μg epibatidine和25 nmol Aβ_31-35并未进一步加强Aβ_31-35对LTP的压抑效应，与单独使用Aβ_31-35作用相似，HFS后60min时LTP值为118．3±1．8％（n=6）。（5）侧脑室注射α4β2亚型nAChRs特异性拮抗剂dihydro-beta-erythroidine（D-beta-E），对基础突触传递和HFS诱导的LTP均无影响；但联合给予D-beta-E和Aβ_31-35后能部分地反转Aβ对LTP的压抑作用，HFS后60 min时，LTP值由单独给予Aβ_31-35时的114．3±4．1％增加到132．2±7．5％（n=6）。（6）双脉冲易化（PPF）实验中，侧脑室给予生理盐水、各种Aβ片段、epibatidine、D-beta-E、合用epibatidine和Aβ_31-35，以及D-beta-E和Aβ_31-35，均未发现双脉冲刺激引起的fEPSPs比值的明显变化。以上结果表明：（1）Aβ_31-35和Aβ_25-35对在体海马LTP诱导具有同等程度的伤害作用，支持我们先前提出的假设，即Aβ_31-35可能是全长Aβ分子中一个更短的具有类似神经毒性作用的活性片段；（2）α4β2亚型nAChR介导了Aβ对在体海马CA1区LTP的压抑作用，提示α4β2亚型nAChR可能是AD时Aβ的攻击靶标之一；（3）Aβ或epibatidine对大鼠在体海马CA1区LTP的压抑作用以及D-beta-E的反转效应与突触前神经递质的释放无关。第二部分：淀粉样β-蛋白对大鼠急性分离的海马CA1区神经元nAChRs全细胞膜电流的影响本实验利用全细胞膜片钳技术，在钳制电位为-70 mV时，通过重力灌流系统急性给予各种nAChRs激动剂及不同的Aβ片段，记录了急性分离的大鼠海马CA1区神经元nAChRs介导的全细胞电流，观察了不同的Aβ片段对非选择性nAChRs激动剂nicotine、特异性α7nAChRs激动剂choline和特异性α4β2 nAChRs激动剂epibatidine诱发电流的影响。实验结果显示：（1）单独应用高浓度（10μM）的Aβ_25-35、Aβ_31-35或Aβ_35-31，均不能诱导出任何明显的跨膜电流；（2）急性给予10μN、100μM和1mM的nicotine，可剂量依赖性诱发内向跨膜电流，诱发的平均电流密度分别为13．44±0．84 pA／pF（n=16）、18．9±0．96pA／pF（n=13）和27．0±1．74 pA／pF（n=15）；（3）α7 nAChRs特异性激动剂choline和α4β2nAChRs特异性激动剂epibatidine均可在海马CA1神经元诱发内向全细胞电流，其平均电流密度分别为21．4±1．52 pA／pF（n=12）和11．24±0．87 pA／pF（n=10）；（4）α7 nAChRs和α4β2nAChRs介导的膜电流有不同的脱敏特征：α7 nAChRs电流的脱敏较快，其快、慢时间常数分别为224．52±39．73 ms和2850．49±491．23 ms（n=12）；α4β2 nAChRs电流的脱敏比较慢，其时间常数分别为604．69±89．08 ms和8809．43±1033．03 ms（n=10）；（5）不同浓度（0．1、1或10μN）的Aβ_25-35预处理3 min后，1 mM nicotine诱发的电流受到不同程度的可逆性的压抑，电流密度值分别降低至68．5±7．2％（n=8，P<0．01），54．5±7．9％（n=8，P<0．01）和40．3±4．0％（n=8，P<0．01），和给药前的对照（100％）相比，均有统计学差异；（6）Aβ_31-35（1μM）预处理对nicotine电流也具有类似的压抑作用，nicotine诱发的电流下降到54．1±6．7％（n=8），和处理前相比显著降低（P<0．01），但和同样浓度的Aβ_25-35效应（54．5±7．9％）相比，则无统计学差异（P=0．89）；（7）给予Aα_31-35的反序列即Aβ_35-31预处理后，nicotine诱发的电流未出现明显改变；（8）特异性α7 nAChRs激动剂choline和特异性α4β2 nAChRs激动剂epibatidine诱发的全细胞电流同样可被1μM的Aβ_31-35预处理所压抑，两者的电流密度值由Aβ_31-35预处理前的对照值（100％），分别降低到57．6±5．3％（n=8，P<0．01）和72．1±6．7％（n=8，P<0．01）。以上结果显示：（1）在急性分离的大鼠海马CA1区神经元，nicotine、choline和epibatidine都可以有效的诱发内向电流，表明在海马神经元上同时有α7和α4β2亚型的nAChRs存在，并且，它们介导的电流有不同的脱敏特征；（2）各种Aβ片段预处理对nicotine、choline和epibatidine诱发的电流有可逆性压抑作用，表明α7和α4β2亚型的nAChRs在AD病理过程中可能是Aβ分子发挥神经毒性作用的生物靶；（3）Aβ_25-35和Aβ_31-35在压抑nicotine电流中表现出的相似作用，提示Aβ_31-35可能是全长Aβ发挥压抑nicotine电流效应时更短的活性片段。第三部分：淀粉样β-蛋白对细胞内钙离子浓度的影响及其可能的nAChRs机制本实验使用激光扫描共聚焦显微镜成像系统进行细胞内荧光Ca²⁺成像实验，观察了各种Aβ片段对原代培养的大鼠皮层神经元细胞内Ca²⁺浓度(intracellular calciumconcentration，[Ca²⁺]_i)的影响，并通过使用nAChRs的非特异性拮抗剂mecamylamine（MCA）以及α4β2亚型nAChRs特异性拮抗剂dihydro-beta-erythroidine（D-beta-E）初步探讨了Aβ引起[Ca²⁺]_i升高过程中可能的nAChRs机制。实验结果显示：（1）Aβ_25-35或Aβ_31-35均可剂量依赖式引起[Ca²⁺]_i升高。细胞外分别给予6．25μM、12．5μM和25μM Aβ_25-35后，神经元的相对荧光密度由给药前的对照值（100％）明显上升到119．5±3．9％（n=36）、136．8±7．7％（n=21）和160±10．9％（n=20）；给予三种相同浓度的Aβ_31-35后，相对荧光密度也分别从对照值（100％）升高到122．4±4．18％（n=28）、134．4±7．9％（n=37）和151．2±6．4％（n=26）；Aβ_25-35和Aβ_31-35升高[Ca²⁺]_i的效应，在相同浓度组之间没有发现显著性差异；给予Aβ_31-35的反序列Aβ_35-31后，皮层神经元[Ca²⁺]_i没有明显变化。（2）使用nAChRs的非特异性拮抗剂MCA（1μM、10μM和100μM）预处理培养的神经元30 min后，Aβ_25-35或Aβ_31-35（均为25μM）诱导的[Ca²⁺]_i升高效应被部分阻断，并表现出一定程度的剂量依赖性。其中，Aβ_25-35（25μM）引起的相对荧光密度值，在三种浓度的MCA存在下，由单独给予Aβ_25-35时的160±10．9％分别下降为138．5±6．5％（n=27）、126．2±6．7％（n=17）和117．9±9．9％（n=20）；Aβ_31-35（25μM）引起的相对荧光密度则由151．2±6．4％分别下降为132．1±8．9％（n=17）、123．4±8．9％（n=22）和1 14．8±8．3％（n=20）。同单独使用Aβ_25-35或Aβ_31-35相比，合用MCA和Aβ_25-35或Aβ_31-35后，[Ca²⁺]_i均明显下降（P<0．01）。（3）使用10μMα4β2亚型nAChRs特异性拮抗剂D-beta-E预处理30 min，同样可以明显地压抑25μM Aβ_25-35或Aβ_31-35诱导的[Ca²⁺]_i升高。与单独使用Aβ_25-35或Aβ_31-35相比，合用D-beta-E和Aβ_25-35或Aβ_31-35后，其相对荧光密度分别从160±10．9％和151．2±6．4％下降到150．3±8．5％（n=28，P<0．05）和141．0±7．3％（n=22，P<0．05）。钙成像实验结果表明：（1）Aβ_25-35和Aβ_31-35均可使原代培养的皮层神经元[Ca²⁺]_i升高，提示Aβ的神经毒性与Aβ引起的细胞内钙超载有关；同时，两个Aβ片段发挥效应的一致性说明Aβ_31-35可能是全长Aβ分子中具有同样生物活性的更短片段。（2）nAChRs，包括α4β2亚型，至少部分地参与了Aβ_25-35和Aβ_31-35诱导的[Ca²⁺]_i升高；中枢nAChRs的功能障碍可能是Aβ引起神经元Ca²⁺超载和导致认知功能损害的原因之一。总之，本研究利用电生理的细胞外场电位记录和全细胞膜片钳手段，结合激光扫描共聚焦显微镜Ca²⁺荧光成像技术，通过记录大鼠在体海马LTP、引导急性分离海马CA1神经元nAChRs电流以及测定神经元细胞内钙离子水平的变化，探讨了与AD发病密切相关的Aβ的神经毒性作用以及可能的nAChRs机制。研究结果不仅表明，Aβ_31-35和Aβ_25-35均可明显压抑大鼠在体海马LTP的诱导、可以有效升高细胞内的Ca²⁺浓度，而且证实了nAChRs，包括α4β2以及α7亚型对于Aβ产生的LTP压抑和细胞内钙超载作用都是必须的。本研究结果有助于进一步认识AD病程中发生认知损害的烟碱受体机制，为解释AD时出现的学习记忆功能障碍提供了一定的证据，为保护神经元免受Aβ伤害提供了线索。同时，实验结果也进一步支持我们先前的假设：31-35片段可能是Aβ分子发挥神经毒性作用的活性中心。