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2005年,Allander从患有呼吸道感染疾病的幼儿鼻咽物中鉴定出一种未知的DNA病毒,通过对这一新发现的病毒进行序列分析,发现该病毒基因组序列同博卡病毒属的牛细小病毒(bovine parvovirus, BPV)和犬细小病毒(minute virus of canines, MVC)基因组序列有较高的同源性,因此该病毒被命名为人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)。随后,其他研究者又分离鉴定出另外三种人博卡病毒基因型,分别为HBoV2,3和4。人博卡病毒是继细小病毒B19之后,第二种能对人类致病的细小病毒,该病毒通常在急性呼吸道感染的儿童患者鼻咽物中检测到,世界范围内均有广泛的流行病学报道,检出率一般介于2-19%。HBoV1易同多种常见的呼吸道病毒共感染,被认为是两岁以下儿童呼吸道病毒感染疾病中,继呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)、腺病毒(adenovirus, ADV)和鼻病毒(rhinovirus, RhV)之后,第四种重要的病毒感染源。同其它细小病毒类似,HBoV1是小DNA分子病毒,基因组全长约5kb,无包膜,呈二十面体结构。基因组编码三个开放阅读框(open reading frame, ORF),两个非结构蛋白(nonstructural protein) NS1及NP1,和两个结构蛋白(capsid protein) VP1及VP2。由于没有合适的动物模型和高滴度HBoV1I临床样本,感染性克隆的构建又受阻于难以获得病毒基因组末端回文序列(ITR),因此,长期以来对HBoVl的研究多局限于流行病学方面,而有关病毒致病机制的研究报道甚少。本研究从感染社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia)的儿童患者呼吸道鼻咽物中,分离鉴定出HBoV1,并以此病毒基因组构建HBoV1的全基因组克隆。以该克隆为工具,通过反向遗传系统成功纯化制备大量HBoV1,建立了支持HBoV1高效复制、感染的体外细胞模型。研究结果为深入揭示人类博卡病毒感染途径和致病机理提供理论基础,将促进病毒性呼吸道感染的预防和治疗。本论文的研究主要取得了以下几个方面的进展：通过分析博卡病毒属三种病毒(HBoV1, BPV, MVC)的基因组序列以及基因组左右两端的发夹结构(left end hairpin, LEH和right end hairpin, REH),发现HBoV1和BPV的LEH碱基序列及二级结构高度同源；HBoV1和MVC的REH碱基序列及二级结构几乎完全一致。据此设计多组引物,以分离的HBoV1阳性样本DNA为模板,成功扩增出HBoV1的LEH和REH,经过测序分析,首次获知HBoV1全基因组序列,并且确证HBoV1基因组具有博卡病毒基因组典型特征。通过分子生物学方法,构建了含有HBoV1全基因组克隆,命名为pIHBoV1,此序列已提交到GenBank (JQ923422)。将pIHBoVl转染到HEK293(human embryonic kidney293)细胞经southern blot实验检测,发现pIHBoV1在没有ADV的条件下仍可高效复制,并且观察到复制过程中产生的三种典型DNA结构形态：抗限制性核酸内切酶(DpnI)的dRF DNA, mRF DNA,和ss DNA。定点突变分别敲除HBoV1的NS1、NP1、VP1和VP2基因,发现NS1对病毒复制必不可少,NP1对病毒复制具有重要作用,而VP1和VP2对病毒复制则无明显作用。通过将pIHBoV1大规模转染到HEK293细胞以及氯化铯梯度离心纯化,最终制备得到病毒粒子,电镜观察发现该纯化的病毒粒子具有细小病毒颗粒的典型特征：二十面体结构、直径约26nm。用纯化制备的HBoV1从气液界面培养系统(air-liquid interface, ALI)的上层小室(apical surface)感染(MOI750vgc/cell, viral genome copies per cell)完全分化的原代人呼吸道上皮细胞(polarized primary human airway epithelia, polarized primary HAE),发现HBoV1不仅感染primary HAE,还可以复制并持续产生子代病毒；更重要的是HBoVl的感染能破坏primary HAE的紧密连接屏障(tight junction barrier),导致纤毛脱落,和上皮细胞肥大等病变,这是呼吸道组织损伤的典型特征。随后,对HBoV1子代病毒和宿主细胞primary HAE之间的关系进行了更详细的研究,结果显示：子代病毒不仅可以在极低MOI (0.001vgc/cell)条件下从上层小室感染primaryHAE：还可以在MOI为1vgc/cell时,从下层小室(basolateral surface)感染primary HAE。且无论从上层小室,还是从下层小室,子代病毒感染均能破坏primary HAE的紧密连接屏障、导致纤毛脱落和细胞肥大。综上,本研究首次从临床样本中测序获得人博卡病毒全基因组序列,成功构建HBoVl感染性克隆pIHBoV1,并在模拟人体呼吸道上皮组织的体外培养体系中建立了HBoV1的高效感染复制模型。本研究提供了病毒和宿主细胞这两个病毒研究中最基本、最重要的先决条件,因此将极大促进对HBoV1感染机制和致病机理的各项研究。同时,本文的研究结果还强烈示HBoV1是一种能持续性感染的呼吸道病毒,由于HBoV1具有宿主特异性和共感染等特点,因此在临床方面对婴幼儿感染呼吸道病毒的检测显得尤为重要。