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实验一微管蛋白折叠辅助因子B(TBCB)在星形胶质细胞突起形成中的作用及机制研究目的:探讨微管蛋白折叠辅助因子B(Tubulin folding cofactors B,TBCB)在星形胶质细胞中的作用、作用机制及调控机制。从TBCB对神经系统中星形胶质细胞(星胶细胞)的微管生物合成及动态平衡调节的角度入手,揭示TBCB在星胶细胞及其突起生长发育过程中的作用及机制,为临床提供理论基础。方法:实验分为三个部分,第一部分实验:研究TBCB在星形胶质细胞突起形成中的作用。原代培养小鼠星胶细胞,分别给与星胶细胞急、慢性酒精暴露,以及siRNA TBCB沉默处理。用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测慢性酒精暴露对星胶细胞的活性影响。在免疫荧光(Immunoflourescent,IF)实验中,用多聚甲醛固定星胶细胞,保持细胞膜完整,检测胞浆内溶解的及与骨架蛋白结合的蛋白。用α-微管蛋白(α-tubulin,α-T)标记微管(MT)的形态变化,观察在不同的刺激下,TBCB与MT的表达变化,以及星胶细胞的形态变化,研究TBCB对微管的作用及该机制对星胶细胞突起生长的影响。用定量逆转录PCR(Quantitative Reverse Transcription PCR,qRT-PCR)和免疫印迹(Western Blot,WB)检测TBCB与α-T蛋白和mRNA含量的改变情况。第二部分实验:研究TBCB影响星形胶质细胞突起生长的机制。EBs(End-binding proteins)是MT阳性端的示踪蛋白,EB1可与TBCB结合,而EB3具有与EB1相同的可与TBCB结合的结构域。本课题组前期证明了EB3也可与TBCB结合。本部分实验拟揭示TBCB是否通过EB1、3绑定并调节MT阳性端,从而影响星胶细胞的生长。本部分实验的IF检测,均采用甲醇和丙酮(1:1)固定细胞,使胞浆内溶解的蛋白流出,仅显示胞内MT及绑定在其上的蛋白。用siRNA沉默TBCB、EB1的表达,以及用慢病毒过表达TBCB之后,用IF检测TBCB和EB1在微管阳性端的表达变化;用WB和qRT-PCR检测TBCB与EB1蛋白和mRNA含量的改变。另外,再分别给予星胶细胞慢性酒精暴露,siRNA沉默及慢病毒过表达TBCB或EB3的处理,用WB和qRT-PCR检测,研究TBCB与EB3蛋白和mRNA的变化关系;用IF检测二者在MT阳性端的表达定位改变。第三部分实验:研究TBCB表达调控机制。分别给与星胶细胞急、慢性酒精处理,siRNA沉默或慢病毒过表达TBCB后,用WB检测p-PAK1及MAPK(ERK,p38、JNK)各条信号通路中蛋白磷酸化改变情况。再分别使用激动剂、抑制剂干扰PAK1及MAPK各条信号通路,WB检测TBCB的表达变化情况,研究TBCB表达的调控机制。结果:第一部分实验:CCK8结果显示,慢性酒精暴露对星胶细胞的活性影响呈剂量依赖性,酒精浓度越高,活性越弱。IF结果显示,正常对照组星胶细胞(Con)和阴性对照组星胶细胞(NC)内,TBCB弥散或沿MT分布,与α-T共表达,在星胶突起处以及核周MT组织中心表达极其丰富;MT自MT组织中心发出,呈放射状直线条,密集、规整的排列。在急、慢性酒精干扰及TBCB沉默(siTBCB)后,TBCB与α-T表达同步降低,且对酒精呈剂量依赖性;星胶突起明显减少;TBCB在核周MT组织中心处,表达变化不明显,而在细胞突起处则明显减弱;MT数量明显减少,以细胞突起处为甚,且阳性端排列紊乱、卷曲。WB和qRT-PCR结果显示,在急、慢性酒精干扰及TBCB沉默后,TBCB与α-T蛋白和mRNA的表达同步降低(p<0.05)。以上结果表明星胶细胞内TBCB的改变影响MT的表达,以MT阳性端最为明显;TBCB亦影响星胶细胞的生长,以MT阳性端最活跃的细胞突起处为甚。提示TBCB的改变,影响MT阳性端的生长,从而影响星胶突起的形成、生长。第二部分实验:IF显示,在Con和NC组星胶细胞中,TBCB沿MT表达,特别在位于细胞周边的MT阳性末端,表达异常丰富,其表达模式类似“拖尾的彗星”,“彗星头”朝向细胞周边,逐渐减弱的“彗星尾”朝向细胞中心;EB1、3在MT阳性端与TBCB共表达,亦呈“彗星状”。慢性酒精暴露,以及分别单独沉默TBCB、EB1或EB3(siTBCB、siEB1或siEB3)后,IF显示,上述干扰导致三者或其它两个蛋白表达密度及荧光强度明显降低,MT阳性端“彗星状”的表达明显减少或消失;WB及qRT-PCR结果亦证实TBCB、EB1和EB3的蛋白和mRNA含量同步降低(p<0.05)。另外,慢病毒过表达TBCB或EB3后,TBCB和EB1、EB3蛋白和mRNA含量亦同步增高(p<0.05)。TBCB、EB1、3均可与MT阳性端结合;干扰后,三者的变化相互影响。提示TBCB可通过与EB1及EB3绑定,调节MT的阳性端的生长,从而影响星胶突起的形成、生长。第三部分实验:WB结果显示,星胶细胞在急、慢性酒精暴露,以及沉默或过表达TBCB后,PAK1及ERK、p38信号通路中蛋白发生改变,其中ERK通路变化最明显,JNK信号通路未发现明显变化;用激动剂和抑制剂分别干扰ERK通路,引起TBCB表达的同步改变(p<0.05)。这些结果表明,TBCB表达受ERK信号通路调控,PAK1和p38-MAPK信号通路亦可参与TBCB的表达调控。结论:在小鼠的星形胶质细胞中,TBCB通过与EB1及EB3绑定,与MT阳性端结合并调节其生长,从而影响星胶突起的形成生长;ERK-MAPK信号通路可调控TBCB的表达,PAK1和p38-MAPK信号通路也可能参与TBCB的表达调控,从而影响星胶细胞的生长。实验二水通道蛋白-4(AQP4)在星形胶质细胞划伤后急性期极性表达改变的机制研究目的:通过探寻星形胶质细胞划伤后,水通道蛋白-4(Aquaporin-4,AQP4)极性表达改变的原因,研究外伤性脑水肿的可能发病机制。方法:用SD乳鼠脑组织进行原代星形胶质细胞培养,以离体划伤模型模拟在体的脑损伤。划伤组和对照组于划伤后6 h收取细胞。用免疫荧光(Immunoflourescent,IF)检测AQP4分别与GFAP、以及其锚定蛋白-肌萎缩蛋白(dystroglycan,DG)的表达变化,研究星胶细胞在划伤急性期的反应性和AQP4极性表达的改变,以及该极性变化与其锚定蛋白改变的关系;用IF、免疫印迹(Western Blot,WB)、定量逆转录PCR(Quantitative Reverse Transcription PCR,q RT-PCR)分别检测AQP4、α-DG与β-DG的蛋白及m RNA的表达变化,明确脑外伤后,DG是否与AQP4极性表达变化有关,从而揭示外伤性脑水肿形成的可能机制。结果:IF结果显示,在对照组星胶细胞中AQP4和GFAP共表达呈弥散或点状分布。划伤6h后,GFAP与AQP4仍维持共表达模式,在划伤周围两者表达同步增强,出现融合的斑块状的分布,表明该处星胶质细胞反应性明显增强,且AQP4的极性表达模式改变;同样AQP4和DG在对照组亦共表达,呈弥散或点状分布,划伤后二者表达同步增强为斑块状共表达模式。提示划伤后AQP4的极性表达改变与其锚定蛋白的表达改变有关。WB、q RT-PCR结果显示,划伤后AQP4和DG的蛋白及m RNA表达同步增加,表明AQP4的表达改变与其锚定蛋白的改变有关。结论:划伤后6h,划伤区星胶处于激活状态;该区域AQP4极性表达的改变可能与其锚定蛋白的表达改变有关,从而影响外伤性脑水肿的形成。