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毛母质瘤(Pilomatricoma，PM)，又称钙化上皮瘤，是一种罕见的皮肤良性肿瘤，在皮肤肿瘤中发生率为0.12%。毛母质瘤一般为单发，好发于头颈部，主要表现为坚实可移动的皮内或皮下结节，生长缓慢且多无自觉症状。毛母质瘤源于真皮或皮下的原始上皮胚芽细胞，其向毛母质分化的过程中增殖异常，凋亡受阻而聚集成毛母质瘤。毛母质瘤病理特征表现为嗜碱性细胞-过渡细胞-影子细胞梯度变化，肿瘤中常有钙化累积。散发病例常检测出体细胞中CTNNB1三号外显子突变，这些突变会使β-catenin蛋白稳定性增加，导致其入核量增加，细胞异常增殖而导致肿瘤发生，但是毛母质瘤的种系遗传基因及其致病机制尚不清楚。
本研究收集并鉴定一个常染色体显性遗传的多发性毛母质瘤大家系，家系四代共32人8位患者，家系内患者均在20岁左右发病。肿瘤组织真皮内可见嗜碱性细胞和影细胞，过渡细胞细胞核逐渐消失，胞界清楚。抗凋亡标志物Bcl-2和毛囊分化标志物CD34表达水平随细胞层级变化而变化。同时提取患者外周血及组织样本DNA，PCR和测序鉴定排除了CTNNB1基因突变。取家系中两个患者DNA样本进行外显子组测序，分析鉴定出PLCD1错义突变c.1186G>A，该突变造成其编码的蛋白PLCδ1第396位谷氨酸变为赖氨酸(p.Glu396Lys，简写为p.E396K)，限制性长度片段多态技术验证该突变在家系内与疾病表型共分离，在350例家系外正常汉族人群中未发现上述突变。分别利用CADD、MutationTaster和Provean等工具进行突变功能预测，三者评分为23.7、0.999和-3.62，均预示该突变可能影响蛋白质的功能。
PLCD1编码磷脂酶C家族成员PLCδ1，是细胞内调控磷脂酰肌醇代谢的酶，负责水解细胞膜上磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸PIP2，产生两种第二信使DAG和IP3，通过接受不同的外界刺激信号活化双信使途径，参与调控多种细胞功能。
首先检测PLCδ1突变蛋白磷脂酶活性，原核和真核表达蛋白酶活性研究发现PLCδ1-p.E396K突变体酶活性增高，有更强分解PIP2的能力，产生更多的IP3和DAG。作为第二信使，IP3和DAG可以直接引起PKC的活化，而PKD/ERK1/2作为PKC下游的信号分子，对表皮的发育和功能维持有重要作用，该信号的失衡会导致细胞增殖分化的失衡。对PLCδ1下游信号检测发现该突变能增强PKD和ERK1/2磷酸化，分别加入PKC和PKD抑制剂(G?6983和kbNB142-70)有效抑制了PKD及ERK1/2的磷酸化，证实该突变会引起PKC/PKD/ERK1/2级联通路的过度激活。
进一步检测上述级联信号通路激活对细胞增殖的影响，Q-PCR结果显示体外表达该突变体会下调细胞分化标志基因KRT10、FLG、LOR和IVL表达，上调细胞增殖标志基因p63和CCND1表达。MTT实验发现表达该突变体的细胞比野生型(WT)增殖活性更强，而加入PKD或ERK1/2抑制剂能抑制该突变体促进细胞增殖的能力。
钙化累积是毛母质瘤的典型特征，PLCδ1活性升高会过度分解PIP2，而分布在细胞膜上TRPV6钙通道的活性依赖于PIP2。膜片钳技术发现PLCδ1-p.E396K突变体对TRPV6电生理活性影响与WT相比，TRPV6通道关闭速度更快，TRPV6的功能恢复也被抑制，钙离子内流明显减弱，在胞外积累可能是毛母质瘤钙化的原因。
为了在体内验证以上数据，本文构建了Plcd1E396K/E396K敲入小鼠，Q-PCR显示敲入小鼠表皮分化标志基因表达下调，增殖标志基因表达上调。MTT实验发现Plcd1E396K/E396K原代皮肤角质细胞增殖活性比野生型更强。达8月龄的纯合敲入小鼠，54.5%(6/11)小鼠腹部皮肤出现自发肿瘤，12月龄时肿瘤直径可达1cm。病理分析显示肿瘤内存在大量核皱缩细胞、无核细胞和钙化累积，抗凋亡标志物bcl-2和毛囊分化标志物CD34表达模式与毛母质瘤相似，Plcd1E396K/E396K小鼠成功模拟人类毛母质瘤表型，从模式生物水平证明PLCD1突变可能是该家系毛母质瘤发生的原因。
总之，本文通过对一个多发性毛母质瘤大家系分子遗传分析，发现PLCD1c.1186G>A(p.E396K)突变，该突变引起磷脂酶活性增强并激活PKC/PKD/ERK1/2级联信号促进细胞增殖，该突变还下调TRPV6钙通道活性影响细胞的钙离子内流。Plcd1E396K/E396K小鼠皮肤不仅有较强的增殖活性和肿瘤形成能力，还出现自发肿瘤，表型与人类疾病表型相似，Plcd1E396K/E396K小鼠模拟人类毛母质瘤表型。本研究发现毛母质瘤的第一个种系致病基因PLCD1，初步揭示家族多发性毛母质瘤的发病机制，为毛母质瘤的研究及治疗奠定了基础。
本研究收集并鉴定一个常染色体显性遗传的多发性毛母质瘤大家系，家系四代共32人8位患者，家系内患者均在20岁左右发病。肿瘤组织真皮内可见嗜碱性细胞和影细胞，过渡细胞细胞核逐渐消失，胞界清楚。抗凋亡标志物Bcl-2和毛囊分化标志物CD34表达水平随细胞层级变化而变化。同时提取患者外周血及组织样本DNA，PCR和测序鉴定排除了CTNNB1基因突变。取家系中两个患者DNA样本进行外显子组测序，分析鉴定出PLCD1错义突变c.1186G>A，该突变造成其编码的蛋白PLCδ1第396位谷氨酸变为赖氨酸(p.Glu396Lys，简写为p.E396K)，限制性长度片段多态技术验证该突变在家系内与疾病表型共分离，在350例家系外正常汉族人群中未发现上述突变。分别利用CADD、MutationTaster和Provean等工具进行突变功能预测，三者评分为23.7、0.999和-3.62，均预示该突变可能影响蛋白质的功能。
PLCD1编码磷脂酶C家族成员PLCδ1，是细胞内调控磷脂酰肌醇代谢的酶，负责水解细胞膜上磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸PIP2，产生两种第二信使DAG和IP3，通过接受不同的外界刺激信号活化双信使途径，参与调控多种细胞功能。
首先检测PLCδ1突变蛋白磷脂酶活性，原核和真核表达蛋白酶活性研究发现PLCδ1-p.E396K突变体酶活性增高，有更强分解PIP2的能力，产生更多的IP3和DAG。作为第二信使，IP3和DAG可以直接引起PKC的活化，而PKD/ERK1/2作为PKC下游的信号分子，对表皮的发育和功能维持有重要作用，该信号的失衡会导致细胞增殖分化的失衡。对PLCδ1下游信号检测发现该突变能增强PKD和ERK1/2磷酸化，分别加入PKC和PKD抑制剂(G?6983和kbNB142-70)有效抑制了PKD及ERK1/2的磷酸化，证实该突变会引起PKC/PKD/ERK1/2级联通路的过度激活。
进一步检测上述级联信号通路激活对细胞增殖的影响，Q-PCR结果显示体外表达该突变体会下调细胞分化标志基因KRT10、FLG、LOR和IVL表达，上调细胞增殖标志基因p63和CCND1表达。MTT实验发现表达该突变体的细胞比野生型(WT)增殖活性更强，而加入PKD或ERK1/2抑制剂能抑制该突变体促进细胞增殖的能力。
钙化累积是毛母质瘤的典型特征，PLCδ1活性升高会过度分解PIP2，而分布在细胞膜上TRPV6钙通道的活性依赖于PIP2。膜片钳技术发现PLCδ1-p.E396K突变体对TRPV6电生理活性影响与WT相比，TRPV6通道关闭速度更快，TRPV6的功能恢复也被抑制，钙离子内流明显减弱，在胞外积累可能是毛母质瘤钙化的原因。
为了在体内验证以上数据，本文构建了Plcd1E396K/E396K敲入小鼠，Q-PCR显示敲入小鼠表皮分化标志基因表达下调，增殖标志基因表达上调。MTT实验发现Plcd1E396K/E396K原代皮肤角质细胞增殖活性比野生型更强。达8月龄的纯合敲入小鼠，54.5%(6/11)小鼠腹部皮肤出现自发肿瘤，12月龄时肿瘤直径可达1cm。病理分析显示肿瘤内存在大量核皱缩细胞、无核细胞和钙化累积，抗凋亡标志物bcl-2和毛囊分化标志物CD34表达模式与毛母质瘤相似，Plcd1E396K/E396K小鼠成功模拟人类毛母质瘤表型，从模式生物水平证明PLCD1突变可能是该家系毛母质瘤发生的原因。
总之，本文通过对一个多发性毛母质瘤大家系分子遗传分析，发现PLCD1c.1186G>A(p.E396K)突变，该突变引起磷脂酶活性增强并激活PKC/PKD/ERK1/2级联信号促进细胞增殖，该突变还下调TRPV6钙通道活性影响细胞的钙离子内流。Plcd1E396K/E396K小鼠皮肤不仅有较强的增殖活性和肿瘤形成能力，还出现自发肿瘤，表型与人类疾病表型相似，Plcd1E396K/E396K小鼠模拟人类毛母质瘤表型。本研究发现毛母质瘤的第一个种系致病基因PLCD1，初步揭示家族多发性毛母质瘤的发病机制，为毛母质瘤的研究及治疗奠定了基础。