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牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCoV)主要引起新生犊牛腹泻、成年牛冬季腹泻和牛呼吸道疾病,在全球范围内造成了严重的经济损失。血清流行病学资料显示国内BCoV阳性率高且分布广泛,但关于BCoV的病原流行病学资料欠缺。本研究的目的是开展国内部分地区奶牛BCoV分子检测及基因组研究,同时研制基于重组N蛋白间接ELISA抗体检测试剂盒,取得如下成果:1.国内部分省区奶牛冠状病毒的分子检测2017年9月到2018年5月,采集了6省14个奶牛场的190份犊牛腹泻粪便样本,采用特异性RT-PCR方法检测BCoV的阳性率,并选取代表性样本同时克隆纤突蛋白(S)、血凝素/酯酶蛋白(HE)、核衣壳蛋白(N)和跨膜蛋白(M)的完整基因,分析其分子特征。结果表明,BCoV的检测率为18.95%,场阳性率为92.86%(13/14),表明BCoV在采样省区的奶牛中广泛流行;从4个省8个牛场的13个阳性样本中同时成功扩增出完整的S、HE、N和M基因,与GenBank中的全部163条完整BCoV S基因相比,本实验克隆的12条序列和中国其它13个毒株(12株牦牛和1株奶牛)在进化树上聚为独立一大支,且在S2亚基上均具有相同的氨基酸突变(N1192Y);另外1条S基因与3个美国BCoV毒株独立聚为一小支。与GenBank中的115条完整BCoV HE基因相比,本实验克隆的10条和中国其它2个毒株(1株牦牛和1株奶牛)在进化树上聚为独立一大支,在HE的R2-loop上具有1个相同的氨基酸突变(F181V)。值得注意的是,13株毒株中有10株被鉴定为HE重组毒株且重组事件相同,重组区域位于HE酯酶和凝集素结构域之间,可能对HE的受体结合功能产生影响;并且这10株重组毒株来自4个省8个牛场,表明这种重组毒株已在国内广泛流行。这是首次在奶牛中发现BCoV HE重组事件,也是首次在国内对奶牛BCoV进行分子检测,有助于进一步了解BCoV的流行和遗传进化,为国内奶牛腹泻的防控提供了重要参考。2.奶牛冠状病毒的基因组研究为进一步研究奶牛BCoV HE重组毒株的分子特征,根据GenBank中公布BCoV基因序列设计了44对引物,扩增BCoV SWUN/A10/2018分离株的基因序列,使用SEQMAN软件(version 7.0;DNASTAR Inc.,WI,USA)组装病毒基因组,分析其基因组特征。结果表明,该毒株完整基因组全长为31028 bp,G+C%的含量为37.0%。该分离株与GenBank中唯一的国内BCoV毒株AKS-01遗传关系最近,其核苷酸和氨基酸的相似性分别为99.0%和98.3%。与已知的全部177个BCoV完整S基因(包括本研究克隆的13个完整的S基因)相比,该毒株在S1区有一个独特的氨基酸突变(G411A)。该毒株HE基因在酯酶和凝集素结构域发生重组,并且在受体结合域R3-loop上有12个核苷酸的插入导致4个氨基酸插入。基于BCoV HE血凝素酯酶的晶体结构建立的3D模型显示,该毒株在R结构域与已知BCoV毒株相比变化明显。鉴于BCoV HE基因在病毒感染过程中参与受体识别和诱导中和抗体的产生,这种HE基因独特的变化可能对其功能的产生影响。这是首次发现BCoV HE基因受体结合域的氨基酸插入事件,对深入了解牛BCoV的遗传进化有重要意义。3.基于重组N蛋白检测BCoV抗体的间接ELISA试剂盒的研制对国内BCoV流行毒株N基因序列进行大肠杆菌的密码子偏好性优化,合成两端增加酶切位点BamH1和Xho1的N基因编码框序列,构建了pET28H表达质粒,转化Rosetta(DE3)中进行了表达。结果表明,BCoV N基因在DE3表达系统中获得了高效表达,Western blot检测证明重组N蛋白具有良好的反应原性。以纯化的N蛋白作为包被抗原,通过反应体系和反应条件的优化,成功建立了基于重组N蛋白的间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性和稳定性,灵敏度高。在此基础上组装的试剂盒与瑞典Svanova公司商品化冠状病毒抗体检测试剂盒的符合率为100%。对来自川西北571份牦牛血清进行了BCoV抗体检测,阳性率为98.1%,表明川西北牦牛的BCoV感染非常普遍,为牦牛腹泻的防控提供了参考。