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口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一。在许多OSCC的致病因素中,槟榔咀嚼与OSCC风险增加之间有明显的相关性,尤其是在印度大陆和东南亚地区国家,包括中国大陆部分省份。然而咀嚼槟榔对OSCC的化疗敏感性的影响仍然缺乏相应研究。自噬是一种细胞内适应性反应,可在各种应激下维持能量平衡,如缺氧,饥饿,缺血/再灌注等;尽管自噬在OSCC的治疗中的作用尚有争议,但自噬已经成为癌症预防和治疗中的潜在抗癌靶标。活性氧(ROS)可通过诱导DNA损伤导致基因组不稳定;同时ROS信号可诱导细胞发生自噬,而自噬又起到减少氧化损伤的作用;ROS水平亦可与肿瘤细胞干性以及化疗耐药相关。槟榔提取物可在癌细胞和正常口腔上皮细胞中诱导ROS升高,同时可通过ROS发生诱导自噬发生。然而,由槟榔提取物诱导的ROS和自噬调控顺铂耐药性的潜在分子调控机制尚不明确。腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)在能量代谢中起重要作用,其同样可以由ROS信号引发;AMPK激活下调mTOR的活化,而mTOR是抑制自噬的关键负性调节信号。本课题通过相关研究证明低浓度槟榔提取物长期刺激OSCC可诱导自噬的发生,并可通过自噬参与OSCC细胞对顺铂的抵抗,同时ROS和AMPK/mTOR信号通路在该过程起到关键作用。根据本研究结果,为咀嚼槟榔导致的OSCC患者的化疗提供潜在优化策略。第一部分低剂量槟榔提取物长期刺激口腔鳞癌细胞对胞内活性氧(ROS)及自噬水平的影响目的:研究低浓度槟榔提取物长期刺激OSCC细胞后,细胞内ROS及自噬水平的变化;探讨槟榔提取物导致的ROS和自噬水平升高之关系;同时研究咀嚼槟榔导致的OSCC原发灶组织中自噬特异蛋白LC3的表达情况。方法:采用新鲜槟榔果制备槟榔提取物水溶液,设置不同浓度梯度的槟榔提取液刺激口腔鳞癌细胞系,检测槟榔提取液对特定肿瘤细胞系的毒性作用及其与浓度的关系;筛选出合适的浓度用于长期(6天)刺激口腔鳞癌细胞系用于后续研究;利用DCF-DA染色通过荧光显微镜以及细胞流式技术检测细胞内ROS 水平;通过Western Blot检测OSCC细胞内自噬相关蛋白的表达,采用荧光显微镜及细胞流式技术检测细胞内MDC染色水平。利用ROS清除剂NAC预处理细胞检测自噬相关蛋白以及MDC染色水平强度研究该过程中ROS与自噬的关系。采用免疫组织化学方法,纳入术前使用顺铂治疗的OSCC患者82例,以42例无咀嚼槟榔习惯的OSCC患者的原发灶组织作为对照,检测40例有咀嚼槟榔史的OSCC患者原发灶中自噬相关特异性蛋白LC3表达水平,比较两组之间差异并探究OSCC患者顺铂敏感性与LC3表达的关系。结果:1.CCK-8细胞活力检测及Annexin V-FITC凋亡检测发现:当槟榔提取物浓度大于8 μg/mL时,槟榔提取物对口腔鳞癌细胞生存活力的影响表现出了时间及浓度依赖性。当槟榔提取物浓度在1-4μg/ml,细胞活力及凋亡较对照组无显著性差异。2.长期无毒剂量槟榔提取物对口腔鳞癌细胞内ROS以及自噬水平的影响:利用3 μ g/mL槟榔提取物连续刺激Cal-27及Scc-9细胞6天,细胞内DCF-DA荧光水平明显增强,证明槟榔提取物慢性低毒刺激可导致口腔鳞癌细胞内ROS水平增高。根据自噬相关蛋白的表达变化以及MDC染色水平,证明槟榔提取物促进了 OSCC细胞的自噬发生。根据DCF-DA/MDC染色检测以及Western Blot结果提示,活性氧清除剂NAC可有效降低槟榔提取物导致的细胞ROS水平增高;NAC(4mM)预处理可以有效降低MDC染色水平,同时降低自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Atg5-Atg12的表达,而SQSTM1/p62表达水平升高。3.LC3免疫组化染色结果显示:自噬体的分布以点状形式表现于OSCC组织肿瘤上皮细胞的细胞质内;LC3在有咀嚼槟榔史的OSCC患者的原发灶组织中表达较无咀嚼槟榔史者表达升高;在顺铂诱导化疗不敏感的患者中,LC3表达较顺铂敏感组明显升高。结论:综合上述实验结果得到:低浓度槟榔提取物(1-4μg/ml)对细胞无明显毒性作用;而采用低浓度(3 μg/ml)槟榔提取物刺激OSCC细胞6天后,细胞内ROS以及自噬水平明显升高,且自噬水平的升高依赖于ROS信号。第二部分AMPK/mTOR信号通路参与于槟榔提取物上调OSCC细胞自噬水平的研究目的:在槟榔提取物低毒慢性刺激OSCC细胞模式中,利用多种实验技术探究AMPK/mTOR通路对OSCC细胞自噬的作用。方法:槟榔提取物低毒慢性刺激(3 μ g/mL,6天)OSCC后,利用Western Blot及细胞免疫荧光技术,检测AMPK/mTOR通路相关蛋白的表达情况。同时利用AMPK通路抑制剂Compound C预处理OSCC细胞,利用Western Blot技术检测AMPK/mTOR/S6通路以及自噬相关蛋白的表达变化。对不同处理条件下的OSCC细胞,利用细胞免疫荧光技术及共聚焦荧光显微镜对自噬特异标志物LC3进行定位定量分析。同时采用透射电镜对自噬体进行检测,以进一步验证AMPK抑制剂Compound C预处理对摈榔提取物上调胞内自噬的影响。在有咀嚼槟榔史的OSCC患者的临床标本(40例)中,利用免疫组化技术检测p-AMPK以及p-mTOR的表达水平;并通过Spearsman相关性分析,得到p-AMPK/p-mTOR在组织样本中的表达水平同自噬特异性标记物LC3表达水平的关系。结果:1.低毒槟榔提取物慢性刺激口腔鳞癌细胞对AMPK/mTOR通路相关蛋白表达的影响:Western Blot以及细胞免疫荧光检测AMPK/mTOR通路相关蛋白的表达情况,槟榔提取物均可以上调口腔鳞癌细胞内p-AMPK表达水平同时降低p-mTOR/p-S6的表达水平。2.Compound C预处理对槟榔提取物引起AMPK/mTOR通路改变及自噬水平上升的影响:Compound C预处理可以有效降低槟榔提取物所导致的口腔鳞癌细胞自噬水平升高,LC3-Ⅱ较单纯槟榔提取物刺激组表达降低,而p62较单纯槟榔提取物刺激组表达升高;同时Compound C可以抑制槟榔提取物导致AMPK的活化,同时影响其下游mTOR及S6的磷酸化水平。利用细胞免疫荧光技术对自噬特异标志物LC3进行定位定量分析后发现:采用AMPK抑制剂Compound C在槟榔提取物刺激前预处理Cal-27及Scc-9后发现,Compound C可以有效降低槟榔提取物导致的口腔鳞癌细胞内LC3表达。TEM结果发现,槟榔提取物刺激后的Cal-27细胞内,自噬体数较空白对照组明显升高;同样的,采用AMPK抑制剂Compound C可以降低单纯槟榔提取物刺激组Cal-27细胞内自噬体数目。3.p-AMPK/p-mTOR在组织样本中的表达水平同自噬特异性标记物LC3表达水平的关系:在有咀嚼槟榔导致的OSCC患者的临床标本(40例)中,根据免疫组化染色结果和Spearman相关性分析结果,得到组织样本中LC3表达水平同标本中p-mTOR表达水平呈负性线性相关(Y=567.3-48.9X,r2=0.2641,p=0.0007);而 LC3 表达水平同标本中 p-AMPK表达水平呈正线性相关(Y=91.7+66.2X,r2=0.3735,p<0.0001)。结论:槟榔提取物可通过AMPK/mTOR途径介导OSCC细胞的自噬水平上升。第三部分槟榔提取物通过ROS/AMPK途径介导自噬参与OSCC顺铂耐药的体外研究目的:假设槟榔提取物通过ROS/AMPK通路介导的自噬可能与顺铂耐药性相关,通过相关的体外研究探究槟榔提取物参与了 OSCC细胞的顺铂耐药。方法:通过细胞活力测定实验检测顺铂作用于不同处理条件下Cal-27及Scc-9的细胞活性;同时利用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit试剂盒测定不同处理条件下的Cal-27及Scc-9细胞凋亡数目。利用Western blot蛋白印记实验检测顺铂刺激Cal-27后凋亡相关蛋白cl-PARP和cl-caspase3的表达变化。结果:1.槟榔提取物预处理OSCC细胞后顺铂对细胞生存活力的影响:用3 ug/mL槟榔提取物持续处理Cal-27及Scc-9细胞6天后CCK-8测定显示,与对照组相比,槟榔提取物处理的细胞组在顺铂作用后显示出较高的细胞活力。Annexin V-PI双染测定细胞凋亡显示,顺铂诱导细胞凋亡的能力在槟榔提取物处理组的OSCC细胞中下降。结果提示顺铂刺激条件下使用槟榔提取物预处理OSCC可使细胞存活能力升高。2.槟榔提取物通过ROS/AMPK介导自噬上升与顺铂对OSCC细胞毒性的关系:细胞活力测定及凋亡实验得出,在槟榔提取物刺激OSCC细胞期间,通过使用3-MA和NAC预处理可通过ROS/AMPK信号有效阻断自噬水平上升的过程,并使顺铂对OSCC细胞的毒性增强。Compound C亦可一定程度上逆转槟榔提取物处理后的OSCC细胞产生对顺铂的耐药能力。3.顺铂刺激Cal-27后凋亡相关蛋白的表达变化:蛋白印迹结果显示,与对照细胞相比,槟榔提取物处理的Cal-27细胞在顺铂刺激后cl-PARP和cl-caspase3的表达下调;NAC和Compound C可分别部分逆转下调的蛋白表达。结论:顺铂刺激下,由槟榔提取物引起的ROS/AMPK介导OSCC内的自噬水平的上升可以参与顺铂毒性降低的过程,cl-PARP和cl-caspase 3的表达降低可能与该过程中降低的顺铂毒性有关。综上所述,我们的研究结果表明槟榔提取物慢性低毒刺激模式下可以导致OSCC细胞ROS及自噬水平的升高,同时槟榔提取物可以通过诱导自噬而降低顺铂对OSCC细胞的毒性,ROS和AMPK/mTOR信号通路在该过程起到关键作用。