论文部分内容阅读
植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)系是杂交种子生产的基础,也是研究核质互作关系的良好材料,其分子机理研究长期以来是国内外研究的热点和难点。红麻(Hibiscus cannabinus L.)是一年生韧皮纤维植物,是重要的麻纺和造纸原料。因其以收获茎秆和韧皮纤维为主要生产目的,红麻易获得营养体生长优势,其杂种优势利用对红麻育种家具有极大的诱惑力。广西大学周瑞阳教授的创新团队于2001年3月在海南冬繁的红麻野生种UG93中发现了1株雄性不育株,以此为细胞质供体,已选育出7个红麻CMS系,组配出了4个红优系列三系杂交种,我国红麻杂种优势的利用居国际领先水平。研究发现,红麻UG93群体中大部分可育株系可以保持UG93雄性不育株的CMS特性,以此可育株系为细胞核供体,已选育出了UG93A及其保持系UG93B(UG93中具有保持CMS特性的可育株系)。由于二者源于同一品种群体,推测UG93A是UG93B的CMS突变型,UG93B是其野生型。因其为细胞质近等基因系,为研究红麻CMS的分子机理提供了及有价值的研究材料。本研究以红麻CMS系UG93A,保持系UG93B和UG93A/992(恢复系)杂交F1为材料,通过高通量测序、Northern Blot等方法从基因组水平和RNA表水平研究了红麻不育胞质和可育胞质的线粒体基因组结构差异和转录本差异,得到以下主要结论：1利用SMRT测序技术对红麻UG93B线粒体全基因组进行高通量测序,将原始数据过滤和接头去除后,得到67,152条reads，平均长度为5.4k,最长的read达到32kb,测序深度达605×。以长的reads做为种子序列,将短序列比对到长的种子序列,以提高长序列碱基的准确度,得到高质量的长reads 12.1Mb,平均长度为6.7kb,质量值高达Q59。2将过滤后红麻线粒体测序数据进行组装,得到红麻线粒体全基因组是一个序列长度为569,912bp, GC含量为44.9%的环状DNA分子,并绘制了红麻线粒体完成图谱。通过注释软件对红麻线粒体基因进行注释,得出红麻线粒体基因组中共有59个线粒体基因,其中包括36个是蛋白编码基因,3个rRNA基因和20种tRNA基因,这些线粒体序列占总线粒体基因组序列的7.1%,同时预测到375个序列长度大于100bp的orfs,这一部分序列占红麻线总粒体基因组的26%。3红麻UG93B线粒体基因组中总共有50个大小从65-7782bp的重复序列,占总线粒体基因组序列的3.4%。这些重复序列主要以大于100bp重复的序列为主,共有28个,而大于lkb以上的重复序列只有3个。在这些大片段(>=100bp)的重复序列中,除了有3个重复片段有3个拷贝以外,其他的绝大多数以两个拷贝为主,红麻UG93B基因组中,重复序列以正向重复和回文重复为主。4将红麻UG93A线粒体基因组重测序序列与参考序列UG93B线粒体基因组比对,共找到398个SNPs和230个InDels变异位点,其中有362个SNPs分布在基因间或内含子上,占总SNPs变异位点的90%,只有36个SNPs分布在线粒体基因的编码区,占总SNPs的10%。其中有15个SNPs在基因编码区发生同义突变,导致6个线粒体基因的氨基残基组成发生变化。在230个InDels变异位点中,以小片段的InDels为主(1-5bp),占InDel总数的77.4%。而6-31bp的InDe只占总InDel的22.6%。而且绝大多数的InDels位点分布在基因间隔区间和内含子区,仅有11个InDels(占4.8%)分布在基因的编码区。5 利用Northern Blot技术检测了36个红麻蛋白编码的线粒体基因在UG93A. UG93B和F1 (UG93A/992)之间mRNA转录表达的差异,其中只有6个线粒体基因的转录本在不育胞质和可育胞质之间存在差异,它们分别是atp1、atp4、atp6、atp9、 cox3和sdh4,其中,除了atp9以外,其他5个基因的转录本虽然在不育胞质和可育胞质之间有差异,但F1 (UG93A/992)的转录本与UG93A的转录本完全相同,说明这几个线粒体基因与红麻CMS没有直接的关系。6在atp9的转录本中,UG93A的转录本小于UG93B和F1(P3A/992)代,虽然UG93A和F1(P3A/992)胞质相同,由于F1(UG93A/992)中有核恢复基因,影响了atp9在F1(UG93A/992)的表达,进一步推测atp9有可能与红麻CMS有着密切的关系。7红麻atp8基因长度为480bp,编码159个氨基酸残基,而且在其3’侧翼序列中不育系UG93A比UG93B多9bp插入,用反转录PCR (RT-PCR)比较两个材料之间RNA编辑的差异,结果表明,在UG93A中,atp8基因有5个位点发生了RNA编辑,而UG93B中存在6个RNA编辑位点,而且不育系中RNA编辑频率高于保持系。在不育系、保持系和F1 (UG93A/992)之间对atp8进行相对荧光定量表达差异分析,得出atp8在UG93A中相对表达量显著低于UG93B和F1(UG93A/992)。而且,基于atp8 3’侧翼序列不育系UG93A比UG93B多9 bp插入这一特征,开发了一个与红麻雄性不育相关的分子标记,并用于检测与红麻不育胞质相关的种质资源。