子宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌的第二个最常见的恶性肿瘤，在妇科恶性肿瘤中居首位，发病率呈升高和低龄化趋势。目前宫颈癌的发病原因及机制尚未完全阐明，诊断治疗上还有许多问题没有解决，除手术治疗外，其他治疗方法进展缓慢。以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗已成为近几年新的研究热点。 近年来的研究表明，肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管的生成，血管形成在恶性肿瘤的发生、发展及转归过程中起着重要作用。肿瘤血管生成是一包括血管内皮细胞增殖、迁移及细胞外基质降解的多步骤和复杂的过程。肿瘤细胞分泌多种血管生长因子促进血管生成，而新生血管不仅为肿瘤细胞的物质交换提供基础，亦可分泌一些细胞因子，促进肿瘤细胞增殖。肿瘤的血管生成依赖于多种相关因子的诱导和调节，在众多与其有关的因子中，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是迄今鉴定出来的最重要的血管生成因子，具有促进血管内皮细胞分化、增生、迁移和浸润的作用。它与肿瘤的生长、浸润和转移有密切关系，并与肿瘤生物行为相关。目前研究较多的为VEGFA，即通常所指的VEGF。VEGF家族在病理生理性血管生长的过程中起的作用是非常关键的，VEGF抑制剂可以抑制各种肿瘤的病理性血管生长。以VEGF及其受体为靶点的基因治疗是最重要的抗肿瘤新生血管生成策略之一。目前采用的方法包括：抗VEGF及其受体的单克隆抗体，VRGFR酪氨酸激酶(TK)的小分子抑制剂及外源性反义RNA等，其中有些已经进入临床试验阶段。但除采用针对VEGF的外源性反义RNA方法外，其它方法均不能特异性地抑制VEGF，而外源性反义RNA也由于干扰效率低而应用受限。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种重要的转录后基因沉默现象，是指内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)导入细胞时，该序列mRNA发生特异性的降解，并导致基因表达的沉默。作为高效、特异的调节基因表达的技术,RNAi已成为基因功能研究的有力工具，并在某些肿瘤、病毒感染性疾病如艾滋病、白血病等疾病的基因治疗中取得了巨大进展。本研究选择VEGF165作为靶基因，采用实时荧光定量RT-PCR技术对宫颈癌组织及相应的siRNA干涉前后的宫颈癌细胞系Hela细胞VEGF165mRNA及其蛋白表达的影响情况进行检测，同时观察siRNA转染对培养细胞增殖活性的影响，结果表明宫颈癌组织中VEGF-mRNA表达水平明显高于宫颈原位癌组织和正常宫颈组织，且与临床病理之间有良好的相关性，VEGFsiRNA可以有效抑制宫颈癌Hela细胞VEGF-mRNA的表达水平，VEGF蛋白表达明显减弱，细胞生长明显受到抑制，表明VEGF基因在宫颈癌的发生、发展中具有重要作用，VEGF有可能成为治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。针对VEGF的RNA干扰技术为宫颈癌基因治疗提供了新策略，为进一步利用RNAi技术抑制肿瘤血管形成以及局部侵袭和远处转移提供研究基础。 第一部分应用实时荧光定量RT-PCR检测宫颈癌组织中VEGFmRNA的表达的研究 目的研究血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)宫颈癌组织中的表达情况，分析其在肿瘤生长与转移中的作用。 方法采用基于TaqMan探针技术的实时荧光定量RT-PCR法检测了48例宫颈癌组织、30例宫颈原位癌组织和36例正常宫颈组织标本中VEGFmRNA的表达情况，并统计分析其与临床病理参数之间的关系。 结果宫颈癌组织中VEGFmRNA的表达水平明显高于宫颈原位癌及正常宫颈组织的表达水平；宫颈癌组织中VEGFmRNA的表达与肿瘤的组织学类型无明显的相关性；而与肿瘤的临床病理分期、病理分化程度、淋巴结转移、肿瘤直径、深肌层浸润间均呈显著的正相关。 结论本研究采用实时荧光定量RT-PCR技术研究了VEGFmRNA在宫颈癌、宫颈原位癌及正常宫颈组织中的表达。发现：(1)实时荧光定量RT-PCR可以敏感且特异性的检测出宫颈癌VEGFmRNA的表达，且方法准确可靠，操作方便。(2)宫颈癌组织中VEGFmRNA表达水平明显高于宫颈原位癌组织和正常宫颈组织。且与临床病理之间有良好的相关性，提示其在宫颈癌生长、转移和预后过程中起着十分重要的作用。(3)VEGF可能成为治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。 第二部分RNA干扰对血管内皮生长因子在人宫颈癌细胞系Hela细胞中表达及细胞增殖影响的实验研究 目的研究血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的小分子干扰RNA(siRNA)对培养的人宫颈癌Hela细胞增殖的影响，检测VEGF基因及其蛋白表达的情况，了解VEGF基因在宫颈癌发生、发展中的作用，探讨RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用前景。 方法根据siRNA序列设计原则，设计并合成三条VEGF-165序列特异性双链小RNA(siRNA)及一条阴性对照siRNA，应用德国QIAGEN公司RNAiFectTMTransfection试剂盒转染人宫颈癌Hela细胞。筛选出最有效的siRNA干扰序列后，用实时荧光定量RT-PCR方法检测转染后Hela细胞中VEGFmRNA的表达，VEGFmRNA的表达以PCR循环数阈值(Ct值)表示，12h开始观察和检测所产生RNA干扰的效果。WesternBlot方法检测VEGF-165蛋白的表达，MTT及细胞计数法检测siRNA转染对培养细胞生长增殖的影响。 结果VEGFsiRNA转染Hela细胞后，与对照组相比VEGFmRNA表达水平明显下降，VEGF蛋白表达明显减弱，差异有统计学意义(P＜0.05)。实验组Hela细胞生长较对照组明显受到抑制(P＜0.05)，从形态学的角度，实验组的细胞明显变小、皱缩、变圆并开始脱落，而无关序列siRNA及对照则无明显改变(P＞0.05)，随着时间延长，效果越明显，72h干扰效率最高。本实验重复性强，同样的实验重复三次结果一致。 结论VEFsiRNA可以有效抑制宫颈癌Hela细胞VEGFmRNA及其蛋白的表达水平，抑制细胞生长，表明VEGF基因在宫颈癌的发生、发展中具有重要作用。针对VEGF165的RNA干扰技术为宫颈癌基因治疗提供了新策略，为下一步利用RNAi技术抑制肿瘤血管形成以及局部侵袭和远处转移提供研究基础。