论文部分内容阅读
肥胖是常见的能量代谢性疾病,是引起糖尿病、高血压、心脑血管等多种疾病的危险因素。肥胖发生率正逐年增高,并成为全球性的流行性疾病。近年来,肥胖低龄化的趋势日趋突出,儿童与青少年肥胖问题受到广泛关注,探讨肥胖及其并发症的发病机制已成为儿科学的重要研究方向之一。随遗传易感性决定肥胖发生发展的理论获得普遍共识,近年来开展肥胖病因的遗传学研究倍受重视,迄今为止已发现有两百多个基因及多个染色体区域与肥胖相关。已知,解偶联蛋白家族(Uncoupling Proteins,UCPs)是一类位于线粒体内膜上的基因,由于其功能预测可能参与能量代谢,因此其与肥胖发生发展的关系引起关注。解偶联蛋白家族有5个亚型,其中UCP1、UCP2、UCP3三个亚型与肥胖之间的关系已有较多研究,但有关UCP4、UCP5亚型与肥胖关系的研究尚未见报道。本文以UCP4基因为研究切入点,旨在阐明UCPs的多组织表达特征及UCPs在脂肪细胞中的功能。为揭示UCPs基因的多组织表达特征,本文第一部分分别以饮食诱导性肥胖大鼠、遗传性肥胖小鼠两种模型为研究对象,应用RT-PCR技术检测UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5基因在啮齿类肥胖动物白色脂肪、棕色脂肪、脑、骨骼肌、肝脏组织中的mRNA表达。结果发现,无论是饮食诱导性肥胖模型还是遗传性肥胖模型,UCPs基因在白色脂肪、棕色脂肪、骨骼肌、肝脏、脑组织中的表达均有显著变化;其中,UCP4基因在两种模型中除表达于脑组织外,腹膜后脂肪、骨骼肌、肝脏等组织中均有表达,且呈现在饮食性肥胖大鼠腹膜后脂肪组织中表达显著下调的特征,而在遗传性肥胖小鼠仅脑组织中表达有显著变化,从而探讨了UCPs的多组织表达,并证实UCP4基因不仅在脑组织中有表达而且也存在于脂肪组织中,于饮食诱导性肥胖大鼠、遗传性肥胖小鼠两种模型具有不同的多组织表达特征。其中,UCP4基因在饮食性肥胖大鼠腹膜后脂肪组织中表达显著下调的研究结果,为深入开展该基因在脂肪组织中的功能研究提供了理论依据。在此基础上,本文第二部分进一步以3T3-L1脂肪细胞为研究对象,通过构建UCP4基因表达载体、转染3T3-L1前体脂肪细胞株,观察UCP4基因过表达对3T3-L1细胞增殖、凋亡、分化、脂质形成及葡萄糖摄取功能的影响,初步探讨UCP4在脂肪细胞中的功能,以分析该基因与肥胖发生发展的关系。以MDI方案诱导脂肪前体细胞3T3-L1向成熟脂肪分化,应用油红O染色脂滴,结果发现,UCP4基因过表达可显著抑制3T3-L1细胞的分化,与对照相比,脂滴不但出现晚,而且在分化的同一时间点其细胞内的脂滴也较小。进一步应用RT-PCR技术检测细胞分化过程中脂肪细胞的标志基因(C/EBPα、PPARγ、LPL、AP2、FAS)的表达,结果发现UCP4基因过表达可显著抑制脂肪细胞分化的进程,3T3-L1细胞中上述标志基因均表达下调。已知在正常脂肪细胞分化进程中,于诱导分化第八天约95%脂肪细胞成为成熟的脂肪细胞。为观察UCP4基因过表达对脂肪细胞脂质积聚的影响,本文进一步收集诱导分化第8天的脂肪细胞,并测定胞内甘油三酯含量,结果发现UCP4基因过表达可显著降低3T3-L1脂肪细胞中甘油三酯的含量,提示UCP4基因具有影响脂质积聚的功能。采用MTT法检测脂肪细胞增殖、流式细胞仪检测脂肪细胞周期,结果发现UCP4基因过表达可显著促进3T3-L1脂肪细胞增殖,与对照相比,UCP4基因过表达可显著增加S期3T3-L1脂肪细胞数,提示UCP4基因还具有促进脂肪细胞增殖、调节细胞周期等功能。以血清饥饿诱导3T3-L1细胞凋亡,并应用Annexin V-FITC方法检测细胞凋亡率,结果发现UCP4基因过表达可显著抑制3T3-L1脂肪细胞的凋亡,其细胞凋亡率较对照明显减少,提示UCP4基因对3T3-L1的细胞凋亡有保护作用。进一步应用~3H标记的2-脱氧葡萄糖(2-Deoxy-glucose)检测成熟脂肪细胞的葡萄糖摄取率,结果发现UCP4基因过表达可显著降低成熟脂肪细胞的葡萄糖摄取率,其脂肪细胞基础葡萄糖摄取率、胰岛素刺激后的葡萄糖摄取率较对照均显著降低。更进一步采用RT-PCR技术检测成熟脂肪细胞中的GLUT1、GLUT4基因表达,结果发现UCP4基因稳定转染的3T3-L1脂肪细胞株中GLUT1、GLUT4基因的表达较对照均明显下调,提示UCP4基因可能通过影响GLUTs基因的表达而改变脂肪细胞的葡萄糖摄取率,UCP4基因还具有影响胰岛素敏感性的功能。本研究的创新之处在于:(1)本研究首次应用两种肥胖动物模型(饮食诱导、遗传),在整体水平上揭示了UCPs家族各个成员的多组织表达特征;(2)再次证实UCP4基因除表达于脑组织外,腹膜后脂肪、骨骼肌、肝脏等组织中均有表达,并首次发现UCP4基因在饮食性肥胖大鼠腹膜后脂肪组织中呈现表达显著下调的特征,而在遗传性肥胖小鼠中仅脑组织表达有显著变化;(3)针对UCP4在脂肪细胞中的功能进行研究,首次发现UCP4基因能够抑制脂肪细胞分化、抑制脂质积聚,首次发现UCP4基因具有促进脂肪细胞增殖、抑制脂肪细胞凋亡的作用,首次发现UCP4基因还具有抑制成熟脂肪细胞葡萄糖摄取的功能。从而为UCP4基因作为肥胖防治靶标提供了初步的理论依据。