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目的:
本实验分析狼疮性肾炎发病过程中外周血HMGBlmRNA及其蛋白水平、TLR-2、TLR-4、VCAM-1表达变化,并分析与血脂的关系,初步探讨HMGB1在狼疮性肾炎血脂异常发生中的可能作用,为LN血脂异常的防治提供新的治疗策略和实验依据。
方法:
1.各组实验对象外周血中血脂的变化
1)选取河北医科大学第二医院免疫风湿科门诊及住院SLE患者67例,均符合1987年美国风湿病学会(American College of Rheumatology,ACR)SLE的诊断标准。其中没有肾脏损害者30例(SLE组),合并肾脏损害者37例(LN组),与上述67例患者性别年龄相匹配的健康志愿者17例作为正常对照组。所有入组人群均无吸烟史及合并肿瘤和感染性疾病,且所有参与本研究项目者均征得患者同意并签订了知情同意书。采用奥林帕斯Au2700全自动生化分析仪进行血脂分析,记录相应的临床和实验室指标。
2)颈动脉超声检测所有实验对象平卧位,充分暴露颈部,探头轻放于体表,采用美国GE公司LOGIQ7型彩色多普勒超声诊断仪在安静状态下进行检查。
2.HMGB-1、TLR2和TLR4、VCAM-1在各组实验对象外周血中的表达变化随机抽取12例正常对照组、16例系统性红斑狼疮无肾损害组(SLE组)和18例狼疮性肾炎(LN组)患者外周血,采用ELISA检测血清中HMGB1蛋白水平,采用反转录-多聚酶链反应(reverse transcriptase-polymerse chain reaction,RT-PCR)检测上述实验对象外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中HMGB1 mRNA、TLR2和TLR4mRNA的表达变化；流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测外周血血管内皮细胞粘附分子-1(vascular endothelial cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)即CD106在单核细胞(CD14阳性的细胞)中的表达变化。
结果:
1.狼疮性肾炎患者外周血中血脂异常的表达及意义
1)在狼疮性肾炎组(LN组)中TG为(2.14±1.25),TC为(5.58±2.75),LDL为(3.52±2.20),明显高于正常对照组和系统性红斑狼疮无肾损害组(SLE组),而SLE和正常对照组二者相比无统计学意义；HDL在三组中间比较无统计学差异。
2)颈动脉超声技术结果显示,在正常对照组和系统性红斑狼疮无肾损害组中,颈动脉内膜未见明显增厚,血流速率正常,而在LN组患者中仅6例可见颈动脉内膜轻度增厚,呈低回声。
2.HMGB-1、TLR2和TLR4、VCAM-1在狼疮性肾炎患者外周血中的表达及意义
1)、狼疮性肾炎患者外周血HMGB1mRNA和蛋白表达升高ELISA结果显示,LN组血清HMGB1蛋白的表达水平[(9.89±1.74)mg/ml]明显高于正常对照组[(7.89±0.75)mg/ml]和SLE组[(7.75±1.63)mg/ml]；SLE组和正常对照组之间差异无统计学意义；LN组血清HMGB1蛋白水平与蛋白尿呈正相关(r=0.966,P=0.000)；尿蛋白水平大于1.0g/24h的患者血清中HMGB1的表达[(12.31±0.62)mg/ml]明显高于尿蛋白水平小于1.0g/24h的患者[(6.86±0.57)mg/ml]。
RT-PCR结果显示,狼疮性肾炎患者外周血单个核细胞HMGB1mRNA表达明显高于正常对照组和系统性红斑狼疮无肾损害组,而正常对照组和系统性红斑狼疮无肾损害组相比,差异无统计学意义。
2)、TLR-2和TLR-4mRNA在不同实验组外周血单个核细胞中的表达变化RT-PCR结果显示,在狼疮性肾炎患者外周血单个核细胞中TLR-2mRNA表达明显高于正常对照组和系统性红斑狼疮无肾损害组(P<0.05),而系统性红斑狼疮无肾损害组TLR-2mRNA表达虽然高于正常对照组,但无显著性差异。
TLR-4mRNA表达在LN组和系统性狼疮无肾损害组高于正常对照组(P<0.05)而LN组和系统性狼疮无肾损害组相比,无显著性差异。
3)、不同组外周血PBMC中VCAM-1蛋白的表达变化新鲜血直接免疫荧光流式细胞术显示,外周血PBMC中VCAM-1蛋白即CD106在单核细胞表面表达,在LN组其表达明显高于SLE和正常对照组(P<0.05),SLE和正常对照组相比无显著性差异。
4)、相关性分析:
经Pearson或Sperman相关分析显示,血清HMGB1蛋白水平与VCAM-1表达无显著相关(r=0.053,P>0.05)；而与单个核细胞中TLR-2和TLR-4mRNA表达呈显著正相关(r=0.673,0.915,P<0.01):血清中HMGB1蛋白水平与患者的TG、LDL变化呈显著正相关(r=0.536和0.448,P<0.05)；但是TLR-2和TLR-4mRNA表达与VCAM-1表达无显著相关(r=0.176,0.163,P>0.05)。
结论:
1.LN患者发病初期即可出现血脂异常,且伴有颈动脉轻度改变。
2.在狼疮性肾炎发病过程中伴有HMGB-1、TLR2和TLR4、VCAM-1的表达升高,考虑晚期炎症介质HMGB1可能通过与其受体TLR2或4结合,促进VCAM-1的释放,介导脂代谢异常,参与狼疮性肾炎动脉粥样硬化的形成。
综上所述,本实验从临床病例资料方面进行研究,结果显示:晚期炎症介质HMGB1参与了LN发病过程中的血脂代谢,可能是造成血脂升高的可能机制之一。提示,HMGB1将是LN治疗中又一个值得关注的新的分子治疗靶点。但是,该研究仅就临床资料进行了初步探讨,尚需要通过实验动物模型和细胞培养等实验方法对其进行深入的研究和探讨。