研究背景:内皮细胞随着周围环境的变化处于动态平衡状态,并构成脉管系统的重要防御屏障,具有控制血管通透性,平滑肌张力,血管炎性和免疫反应,血管生成以及抗血栓形成等重要生理作用。内皮细胞是多种心血管疾病危险因素的重要靶点,而且研究认为,内皮细胞损伤是多种心血管疾病发生的始动因素。在需氧生命体中,氧化还原反应是十分重要而且作用广泛的生命活动,有助于组织在时空方向的分化和发展,适应环境变化。但是,一旦体内促氧化和抗氧化系统的平衡被打破且促氧化系统占据优势作用时,将会导致机体氧化应激的发生。此时,体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)会发生蓄积,过多的活性氧对机体的破坏作用将远远超过机体的抗氧化和组织修复能力,从而引起组织氧化损伤的发生。研究表明,氧化应激及其相关的内皮功能障碍与高胆固醇血症,糖尿病和慢性吸烟等典型的心血管危险因素显著相关,并在动脉粥样硬化,高血压,血管成形术后再狭窄,血管生成,缺血再灌注引起的心脏损伤以及心力衰竭等重大心血管疾病的发病过程中发挥重要作用。亚临床甲状腺功能减退(Subclinical hypothyroidism,SCH,简称亚甲减)是一种以血清促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)增高,血清甲状腺激素水平正常为特点的常见的甲状腺疾病。成年人亚甲减的患病率高达4%-20%并呈现不断增高的趋势。尽管亚甲减病人无明显的临床症状,但随着病情的进展,亚甲减仍会导致不良后果,包括全身性甲状腺功能减退症状,神经肌肉功能障碍,进展为甲状腺功能减退症,伴发高胆固醇血症和心血管功能障碍等。研究认为血清TSH水平升高是导致亚甲减病人增加心血管疾病发病风险的非传统危险因素。尽管血清TSH升高与血清中的氧化应激及内皮功能障碍相关标志物呈高度正相关,但是TSH升高对内皮细胞的影响及其潜在机制仍有待确定。线粒体是目前已知的调控细胞ROS生成及氧化应激反应的重要亚细胞器。尽管内皮细胞中线粒体含量较低,但内皮细胞的线粒体稳态对维持细胞的氧化还原平衡和正常功能至关重要。线粒体中氧化还原状态的不平衡将导致线粒体产生过多的ROS,线粒体氧化应激的发生将进一步激活内皮细胞ROS的其他来源,如烟碱腺苷二磷酸核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶和黄嘌呤氧化还原酶,引起内皮型一氧化氮合酶(eNOS)解偶联,诱发内皮细胞的氧化应激损伤,最终导致内皮功能紊乱。目前研究发现,线粒体渗透性转换孔(mitochondrialpermeability transition pore,mPTP)对于维持线粒体稳态具有重要作用。MPTP孔的短暂性开放有利于维持线粒体内外离子及代谢物的平衡从而维持正常的线粒体功能。然而,在损伤性因素的刺激下,mPTP孔会过度开放,线粒体发生肿胀及膜破裂,膜电位降低,线粒体内外钙离子平衡状态发生紊乱,促进线粒体功能退化,导致大量线粒体源性ROS的生成并释放入胞浆。亲环素D(cyclophilin D,CypD)是调控mPTP开放的重要蛋白,具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性。CypD在静息状态时位于线粒体基质。然而,活化后的CypD可以从线粒体基质迁移至线粒体内膜,并与内膜上的ANT蛋白或F1F0ATP合酶结合,以便mPTP孔的开放。尽管Marcu,R等人证实了 CypD对内皮细胞的增殖及血管生成作用具有重要影响,但是,CypD介导的mPTP孔开放及线粒体氧化还原状态的改变是否参与了 TSH对内皮功能的影响仍待明确。本课题通过流行病学调查以及体内和体外研究证明,血清TSH水平升高可以导致内皮细胞发生线粒体氧化损伤,并阐明CypD在调节TSH引起的线粒体及内皮功能紊乱中的关键作用。为进一步探讨TSH升高诱发心血管疾病的分子机制提供新观点,从氧化应激的角度为临床靶向治疗心血管疾病提供新思路。研究目的:1、观察TSH升高能否诱导内皮细胞及其线粒体发生氧化损伤。2、观察CypD是否介导TSH诱发的内皮细胞及线粒体的氧化损伤。3、明确TSH升高对内皮细胞CypD的影响及相关的信号通路。研究方法:1、亚甲减人群血清标本获得:研究人群来自2013年-2014年流行病学研究项目(Effects of L-thyroxine Replacement on Serum Lipid and Atherosclerosis in Hypothyroidism,NCT01848171)。2、人群资料获取:人群的一般资料,如性别、年龄、既往的疾病史及用药史等信息通过调查问卷的方式获取。对流调人群进行体格检查以获取身高、体重、BMI、腰臀围以及血压等基本信息。抽取研究对象的空腹血进行甲状腺功能、血脂及空腹血糖检测。血脂及空腹血糖采用BECKMAN全自动生化分析仪AU5800(BeckmanCoulter,Tokyo,Japan)进行检测,血清甲状腺激素和促甲状腺激素采用电化学发光法(Cobas E601;Roche,Basel,Switzerland)进行检测。3、动物模型:3.1构建甲状腺条件性敲除TSH受体小鼠模型:采用Cre/LoxP方案,将Tshrflox/flox鼠与TPO-cre+鼠多次杂交,得到基因型为Tshrflox/flox;TPO-cre+的子鼠即为甲状腺条件性敲除 TSH 受体(thyroid-specific TSH receptor(TSHR)-knockout,TT-KO)小鼠模型。4周龄雄性TT-KO小鼠分笼后给予添加外源性T4的饲料喂养以维持正常甲状腺素水平。TT-KO小鼠分组:为了观察TSH升高对小鼠主动脉内皮细胞的作用,9-10周龄的雄性TT-KO小鼠分别给予皮下注射新鲜配制的TSH(TT-KO+TSH,7 mIU/g·d)或溶媒(TT-KO+solvent);为了观察抑制CypD后是否改善TSH升高引起的内皮损伤,6-7周龄雄性TT-KO小鼠分别给予腹腔注射cyclosporin A(CsA,15mg/kg·d)或PBS 4周,然后在继续注射CsA或PBS的基础上,同时给予皮下注射TSH或溶媒2周(TT-KO+solvent,TT-KO+TSH,TT-KO+CsA,TT-KO+CsA+TSH)。3.2 Tsr-/-小鼠模型:Tshr+/-小鼠繁殖后,子代经基因型鉴定得到Tshr-/-小鼠和同窝对照野生型Tshr+/+小鼠。4周龄雄性Tshr-/-小鼠分笼后给予添加外源性T4的饲料喂养以维持体内正常甲状腺素水平,同窝对照鼠给予普通饲料喂养。3.3 CypD KO小鼠模型:基因型为CypD杂合子的小鼠繁殖后,子代经基因型鉴定得到CypDKO小鼠和同窝对照野生型(WT)小鼠,给予小鼠普通饲料喂养。4、细胞培养:根据ATCC细胞培养的要求培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人动脉平滑肌细胞(HA-VSMC)。5、CypD基因干扰:采用PPIFshRNA腺病毒感染HUVEC的方法特异性干扰内皮细胞的CypD的表达。6、采用ELISA法检测人血清内皮素-1(ET-1)及小鼠血清TSH水平。7、采用放射免疫分析法检测小鼠血清总T4(TT4)水平。8、小鼠机体代谢情况评估:小鼠机体的代谢情况,包括耗氧量(V02)、二氧化碳产量(VC02)、呼吸交换率(RER)、活动(activiy)、产热(heat production)以及小鼠进食情况(feed)采用TSE PhenoMaster动物代谢测量分析系统(简称动物代谢笼系统)进行评估。9、血管舒张功能检测:采用乙酰胆碱和硝普钠分别检测小鼠肠系膜动脉内皮依赖性和内皮非依赖性血管舒张。10、DCFH-DA染色法检测小鼠主动脉及HUVEC的氧化应激水平。11、MitoSox Red染色法检测小鼠主动脉、HUVEC及HA-VSMC的线粒体ROS水平。12、TMRM染色法检测小鼠主动脉、HVSMC及HA-VSMC的线粒体膜电位。13、免疫荧光法检测小鼠主动脉及HUVEC的ET-1、8-OHdG的表达。14、硝酸还原酶法检测HUVEC的一氧化氮释放水平。15、Western-Blot 法检测 HUVEC 的 eNOS、p-eNOS、Akt、p-Akt、catalase、CypD、AMPK、p-AMPK、SIRT3 的表达。16、CypD的赖氨酸乙酰化水平采用免疫共沉淀法进行检测。17、线粒体肿胀检测:将新鲜分离的具有生物活性的主动脉或HUVEC的线粒体重悬于线粒体肿胀检测液中,检测液中加入适当浓度CaCl2(1μmol Ca2+/mg protein),采用 SpectraMax M2/M2e 酶标仪(Molecular Devices)连续读取 11分钟在540nm处的吸光度(optical density,OD)值变化,计算钙负荷触发的线粒体肿胀程度。18、线粒体呼吸链复合酶活性检测:提取细胞或组织的线粒体后采用分光光度法进行线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性检测。19、Seahorse XF96 检测 HUVEC 线粒体耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)。20、高压液相法检测HUVEC的腺苷酸含量,计算腺苷酸能荷(Energy charge)=[ATP + ADP/2]/[ATP + ADP + AMP]。21、统计学方法:采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。数据采用均数±标准差(Mean±SD)或中位数(四分位数间距)(median(inter-quartilerange))表示。血清TSH与ET-1的相关性采用简单线性相关分析。组间差异性分析采用One-Way ANOVA(Dunnett’s t or LSD test)或独立样本 T 检验。认为 p<0.05时组间存在统计学差异。研究结果:1、亚甲减人群血清TSH与ET-1水平正相关在血清TSH>=10 mIU/L的亚甲减病人中,我们发现血清TSH水平与血清中ET-1的水平呈正相关。而且,这部分人群经过左旋甲状腺素(levothyroxine,LT4)治疗后,随着TSH水平恢复至正常范围,血清ET-1水平也明显降低。2、TSH水平升高可以诱发内皮功能紊乱及氧化应激反应我们发现与TT-KO+solvent组小鼠相比,TT-KO+TSH小鼠主动脉及内皮的ET-1表达量明显增加,且伴有主动脉氧化应激水平的升高(DCFH-DA染色)。而且,TSH升高可以抑制小鼠肠系膜动脉内皮依赖性血管舒张反应。应用eNOS抑制剂L-NAME后,TT-KO+TSH小鼠内皮依赖的血管舒张未出现进一步下降,而且,TT-KO+solvent组小鼠内皮依赖性血管舒张反应的减弱程度与TT-KO+TSH小鼠相当。与对照组(Tshr+/+)小鼠相比,TSHR敲除鼠(Tshr-/-)可以对抗TSH升高引起的内皮依赖性血管舒张减弱。体外培养HUVEC实验发现,TSH升高可以呈剂量或时间依赖性地增加ET-1的表达,减少eNOS及Akt的活化并抑制内皮细胞的NO的释放。此外,伴随内皮细胞的功能紊乱,我们发现,TSH可以剂量依赖性地减少HUVEC的catalase的表达,增加细胞整体的氧化应激水平以及细胞DNA的氧化损伤。3、TSH升高可以诱发内皮细胞mPTP孔过度开放及线粒体氧化损伤采用钙负荷诱导线粒体mPTP孔开放实验发现,TT-KO+TSH小鼠主动脉的线粒体在钙负荷诱导下发生明显肿胀。而且,伴随血清TSH水平的升高,小鼠主动脉的线粒体膜电位(TMRM染色)明显降低并伴有线粒体ROS(MitoSox Red染色)显著增加。体外培养HUVEC的实验发现,TSH升高可以增加钙负荷诱导的线粒体mPTP孔开放、降低线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性、增加内皮细胞的线粒体ROS生成并抑制线粒体的有氧呼吸,降低线粒体氧耗率(OCR)。4、CypD介导TSH升高诱发的线粒体及内皮功能紊乱HUVEC感染CypD干扰腺病毒(PPIF shRNA)后可以减少TSH诱导的线粒体ROS增加,改善TSH升高条件下的线粒体氧耗以及内皮细胞功能紊乱,降低ET-1的表达并增加eNOS的活化。此外,我们发现与野生对照鼠相比,CypDKO小鼠可以对抗TSH升高引起的内皮依赖性血管舒张功能降低。为了观察药理学抑制CypD后的作用,在体外实验中,HUVEC给予环孢霉素A(cyclosporin A,CsA,1 μmol/L)预处理1小时后再给予TSH处理24小时,结果发现,CsA缓解TSH升高引起的线粒体肿胀和线粒体ROS增多,改善TSH诱发的线粒体氧耗减少,增加HUVEC的ATP合成并改善TSH引起的能荷减少。CsA预处理细胞还可以对抗TSH升高引起的catalase减少及ET-1表达增加。体内研究发现,TT-KO小鼠给予CsA预处理后,可以改善TSH升高引起的主动脉线粒体肿胀、主动脉线粒体复合酶I和III活性降低以及主动脉线粒体ROS的增加。而且,CsA预处理可以减少TSH引起的主动脉及内皮的ET-1表达增加,并改善TSH升高引起的内皮依赖性血管舒张功能减低。5、TSH通过抑制AMPK/SIRT3信号通路增加CypD赖氨酸乙酰化我们通过体外研究发现,TSH升高可以显著增加HUVEC的CypD的赖氨酸乙酰化水平但对CypD的表达量并无明显影响。TSH剂量依赖性地抑制AMPK Thr-172位点的磷酸化及SIRT3的表达。用AMPK的激动剂AICAR处理HUVEC不仅增加AMPK Thr-172位点的磷酸化及SIRT3的表达,而且还可以对抗TSH升高导致的CypD的赖氨酸乙酰化增加。研究结论:1、TSH升高导致内皮依赖性血管舒张功能降低,线粒体氧化应激的发生是其潜在原因。2、CypD介导TSH诱发的线粒体及内皮功能紊乱。3、TSH通过抑制AMPK/SIRT3信号通路增加内皮细胞CypD的赖氨酸乙酰化。