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目的
研究兔源性肺炎克雷伯菌多重耐药性的形成以及耐药性基因相关可移动遗传元件水平转移引起耐药性广泛传播的分子机制.在动物源性细菌中存在对抗生素具有非常严重的的耐药性,并且在不同来源的不同种属细菌之间,广泛地发生着可移动遗传元件携带耐药基因进行水平转移,导致耐药基因扩散和单个细菌中积累越来越多的耐药基因.本文为肺炎克雷伯菌的多重耐药性的研究提供实验室依据,并对动物源性细菌引起感染性疾病的抗生素治疗提供帮助.
方法
1.对2015年分离自温州地区养殖场兔、鸡、牛、鸭、虾、鹅肛拭子的新鲜粪便标本进行分离纯化细菌,记录信息后,保存于含有25%甘油的保种管,并储存于-80℃冰箱备用.用生化鉴定和16SrRNA测序的方法鉴定所有分离纯化的细菌,确定菌种,挑选出对氟苯尼考高度耐药的菌株肺炎克雷伯菌R46.
2.碱裂解法提取肺炎克雷伯菌R46全基因组,送至北京安诺生物科技公司进行二代(HiSeq2000)和三代(PasicBio)测序法进行全基因组测序;对测序回来的三代测序序列采用Canu软件进行拼接,并使用生物信息学软件结合二代测序的reads对三代拼接序列进行校正.
3.计算统计拼接好菌株R46的全基因组序列特征,如序列长度、GC含量;利用软件对全基因组序列进行开放阅读框架预测(ORFs);使用本地BLAST程序和美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线BLAST,对预测的ORFs进行功能注释.
4.利用RNAmmer在线软件预测菌株R46rRNA序列,包括16SrRNA;利用tRNAscan-SE2.0在线分析软件,预测菌株R46tRNA序列.利用MLST-1.8在线软件预测肺炎克雷伯菌R46的管家基因:gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB,并根据管家基因预测菌株R46所属的生物分型.
5.利用BPROM在线网站,预测菌株R46相关耐药基因的启动子.进行耐药基因及其启动子序列的PCR产物克隆,并测序验证克隆的耐药性基因.接合转移试验,验证菌株R46中质粒能否接合转移.对菌株R46、耐药性基因克隆株、标准菌株,接合子等菌株进行药敏试验,记录它们对抗生素的最低抑菌浓度值.
6.使用在线画图网站CGView和本地GView1.7,对肺炎克雷伯菌R46的三个质粒,pR46-27、pR46-42、pR46-270序列制作圈图,并使用相关软件,对图进行修饰.
7.下载NCBI核酸序列库中包含mdfA的序列,并使用脚本截取mdfA左右4kb序列,最终得到979条,并使用CD-HIT软件对980条序列(包含菌株R46中mdfA序列)进行聚类.使用生物信息学软件及Perl脚本对肺炎克雷伯菌R46携带的耐药基因进行比较基因组学分析.
结果
1.本文共分离培养得到13株肺炎克雷伯菌,其中兔来源4株,鸡来源4株,鸭来源1株,虾来源1株,牛来源3株.通过在线BLAST比对,肺炎克雷伯菌R4616SrRNA基因及染色体DNA序列与肺炎克雷伯菌INF042,肺炎克雷伯菌INF059和肺炎克雷伯菌KSB1_7J最相似,覆盖度和相似度均为99%.
2.肺炎克雷伯菌R46基因组由染色体和三个质粒pR46-27、pR46-42、pR46-270组成,大小分别是5.11Mb、27.06kb、42.64kb、270.57kb;菌株R46属于ST37型,携带34个耐药基因,染色体含有22个rRNA操纵子和87个tRNA序列.
3.接合转移试验及药敏试验证实大质粒pR46-270能够接合转移到大肠杆菌EC600,说明接合转移区能够发挥功能,也能够诱动小质粒pR46-27转移.
4.将大肠杆菌ATCC25922做为质控菌株,结合美国临床实验室标准化协会(CLSI)和欧盟药敏试验标准(EUCAST)颁布的最新版指南文件中的临界值,药敏试验结果测得肺炎克雷伯菌R46对多种抗生素耐药如:氯霉素、氟苯尼考、卡那霉素等抗生素耐药.
5.mdfA2属于多药外排泵,克隆和药敏试验证实其对氟苯尼考具有耐药性;通过下与载的数据进行比对分析发现mdfA2基因两侧的结构保守,周围没有可移动遗传元件.
6.小质粒pR46-27属于IncX1不相容群,编码氟苯尼考耐药基因floR.NCBI数据库中与pR46-27覆盖度最高的三个质粒分别pCTXM-2271、pACN001-A和p160070-CTXM,其中p160070-CTXM不编码floR基因.中质粒pR46-42属于IncX4不相容群,编码两个β类酰胺类耐药基因blaCTX-M-99和blaCTX-M-14.
7.大质粒pR46-270,含有多个复制子,序列可被分为多重耐药区、接合转移维持区和毒力区及重金属耐受区.耐药区编码多种耐药基因,如β类酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等耐药基因.接合转移相关的IV型分泌系统由24个tra基因,5个trb基因和一个finO基因组成.毒力区和重金属耐药区包括两套铁吸收利用系统和对砷、汞等重金属耐受基因簇.
结论
1.肺炎克雷伯菌R46属于ST37型,对多种抗生素具有耐药性,属于多重耐药细菌,与之前报道一致.而全球各地报道肺炎克雷伯菌ST37型多见于临床,而本株肺炎克雷伯菌R46分离自兔,其是否为可引起人畜共患病有待进一步研究.
2.肺炎克雷伯菌R46携带30多个耐药性基因,对检测的11种抗生素具有耐药性,大部分耐药基因位于大质粒pR46-270上,且耐药基因均与可移动遗传元件相关;通过比较分析发现多个耐药片段在不同的菌种中出现,同时质粒能够接合转移,因此其有通过基因水平转移,引起耐药基播散的可能.
3.肺炎克雷伯菌R46对氟苯尼考具有很高的耐药性,floR基因由小质粒pR46-27携带,该质粒能够在大质粒pR46-270的诱动下发生转移.除小质粒pR46-27编码的floR外,发现染色体编码新的对氟苯尼考耐药基因mdfA的变体mdfA2,该基因两侧结构保守,与可移动遗传元件无关.肠杆菌科中同一种属细菌的mdfA基因两侧的结构基本一致.
4.肺炎克雷伯菌R46除含有多重耐药基因外,还有多个耐重金属基因簇和多个毒力基因簇,使该株菌在环境中具有很高的生存能力和致病性.
研究兔源性肺炎克雷伯菌多重耐药性的形成以及耐药性基因相关可移动遗传元件水平转移引起耐药性广泛传播的分子机制.在动物源性细菌中存在对抗生素具有非常严重的的耐药性,并且在不同来源的不同种属细菌之间,广泛地发生着可移动遗传元件携带耐药基因进行水平转移,导致耐药基因扩散和单个细菌中积累越来越多的耐药基因.本文为肺炎克雷伯菌的多重耐药性的研究提供实验室依据,并对动物源性细菌引起感染性疾病的抗生素治疗提供帮助.
方法
1.对2015年分离自温州地区养殖场兔、鸡、牛、鸭、虾、鹅肛拭子的新鲜粪便标本进行分离纯化细菌,记录信息后,保存于含有25%甘油的保种管,并储存于-80℃冰箱备用.用生化鉴定和16SrRNA测序的方法鉴定所有分离纯化的细菌,确定菌种,挑选出对氟苯尼考高度耐药的菌株肺炎克雷伯菌R46.
2.碱裂解法提取肺炎克雷伯菌R46全基因组,送至北京安诺生物科技公司进行二代(HiSeq2000)和三代(PasicBio)测序法进行全基因组测序;对测序回来的三代测序序列采用Canu软件进行拼接,并使用生物信息学软件结合二代测序的reads对三代拼接序列进行校正.
3.计算统计拼接好菌株R46的全基因组序列特征,如序列长度、GC含量;利用软件对全基因组序列进行开放阅读框架预测(ORFs);使用本地BLAST程序和美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线BLAST,对预测的ORFs进行功能注释.
4.利用RNAmmer在线软件预测菌株R46rRNA序列,包括16SrRNA;利用tRNAscan-SE2.0在线分析软件,预测菌株R46tRNA序列.利用MLST-1.8在线软件预测肺炎克雷伯菌R46的管家基因:gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB,并根据管家基因预测菌株R46所属的生物分型.
5.利用BPROM在线网站,预测菌株R46相关耐药基因的启动子.进行耐药基因及其启动子序列的PCR产物克隆,并测序验证克隆的耐药性基因.接合转移试验,验证菌株R46中质粒能否接合转移.对菌株R46、耐药性基因克隆株、标准菌株,接合子等菌株进行药敏试验,记录它们对抗生素的最低抑菌浓度值.
6.使用在线画图网站CGView和本地GView1.7,对肺炎克雷伯菌R46的三个质粒,pR46-27、pR46-42、pR46-270序列制作圈图,并使用相关软件,对图进行修饰.
7.下载NCBI核酸序列库中包含mdfA的序列,并使用脚本截取mdfA左右4kb序列,最终得到979条,并使用CD-HIT软件对980条序列(包含菌株R46中mdfA序列)进行聚类.使用生物信息学软件及Perl脚本对肺炎克雷伯菌R46携带的耐药基因进行比较基因组学分析.
结果
1.本文共分离培养得到13株肺炎克雷伯菌,其中兔来源4株,鸡来源4株,鸭来源1株,虾来源1株,牛来源3株.通过在线BLAST比对,肺炎克雷伯菌R4616SrRNA基因及染色体DNA序列与肺炎克雷伯菌INF042,肺炎克雷伯菌INF059和肺炎克雷伯菌KSB1_7J最相似,覆盖度和相似度均为99%.
2.肺炎克雷伯菌R46基因组由染色体和三个质粒pR46-27、pR46-42、pR46-270组成,大小分别是5.11Mb、27.06kb、42.64kb、270.57kb;菌株R46属于ST37型,携带34个耐药基因,染色体含有22个rRNA操纵子和87个tRNA序列.
3.接合转移试验及药敏试验证实大质粒pR46-270能够接合转移到大肠杆菌EC600,说明接合转移区能够发挥功能,也能够诱动小质粒pR46-27转移.
4.将大肠杆菌ATCC25922做为质控菌株,结合美国临床实验室标准化协会(CLSI)和欧盟药敏试验标准(EUCAST)颁布的最新版指南文件中的临界值,药敏试验结果测得肺炎克雷伯菌R46对多种抗生素耐药如:氯霉素、氟苯尼考、卡那霉素等抗生素耐药.
5.mdfA2属于多药外排泵,克隆和药敏试验证实其对氟苯尼考具有耐药性;通过下与载的数据进行比对分析发现mdfA2基因两侧的结构保守,周围没有可移动遗传元件.
6.小质粒pR46-27属于IncX1不相容群,编码氟苯尼考耐药基因floR.NCBI数据库中与pR46-27覆盖度最高的三个质粒分别pCTXM-2271、pACN001-A和p160070-CTXM,其中p160070-CTXM不编码floR基因.中质粒pR46-42属于IncX4不相容群,编码两个β类酰胺类耐药基因blaCTX-M-99和blaCTX-M-14.
7.大质粒pR46-270,含有多个复制子,序列可被分为多重耐药区、接合转移维持区和毒力区及重金属耐受区.耐药区编码多种耐药基因,如β类酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等耐药基因.接合转移相关的IV型分泌系统由24个tra基因,5个trb基因和一个finO基因组成.毒力区和重金属耐药区包括两套铁吸收利用系统和对砷、汞等重金属耐受基因簇.
结论
1.肺炎克雷伯菌R46属于ST37型,对多种抗生素具有耐药性,属于多重耐药细菌,与之前报道一致.而全球各地报道肺炎克雷伯菌ST37型多见于临床,而本株肺炎克雷伯菌R46分离自兔,其是否为可引起人畜共患病有待进一步研究.
2.肺炎克雷伯菌R46携带30多个耐药性基因,对检测的11种抗生素具有耐药性,大部分耐药基因位于大质粒pR46-270上,且耐药基因均与可移动遗传元件相关;通过比较分析发现多个耐药片段在不同的菌种中出现,同时质粒能够接合转移,因此其有通过基因水平转移,引起耐药基播散的可能.
3.肺炎克雷伯菌R46对氟苯尼考具有很高的耐药性,floR基因由小质粒pR46-27携带,该质粒能够在大质粒pR46-270的诱动下发生转移.除小质粒pR46-27编码的floR外,发现染色体编码新的对氟苯尼考耐药基因mdfA的变体mdfA2,该基因两侧结构保守,与可移动遗传元件无关.肠杆菌科中同一种属细菌的mdfA基因两侧的结构基本一致.
4.肺炎克雷伯菌R46除含有多重耐药基因外,还有多个耐重金属基因簇和多个毒力基因簇,使该株菌在环境中具有很高的生存能力和致病性.