【摘 要】
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烟草曲茎病毒（tobacco curly shoot virus,TbCSV）是Geminiviridae科Begomovirus属的单组分病毒,伴随β卫星（tobacco curly shoot betasatellite,TbCSB）,是引起番茄和烟草曲叶病的重要病原,在我国云南和四川省广泛发生且危害严重。已有许多研究表明,microRNA参与调控植物生长发育及生物或非生物胁迫应答等生命过程。
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（31772127）； 中央高校基本科研业务费“创新团队项目”（XDJK2017A006）；
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烟草曲茎病毒（tobacco curly shoot virus,TbCSV）是Geminiviridae科Begomovirus属的单组分病毒,伴随β卫星（tobacco curly shoot betasatellite,TbCSB）,是引起番茄和烟草曲叶病的重要病原,在我国云南和四川省广泛发生且危害严重。已有许多研究表明,microRNA参与调控植物生长发育及生物或非生物胁迫应答等生命过程。目前对TbCSV和TbCSB致病机制的研究工作主要集中在该病毒编码的蛋白与寄主蛋白的互作,对寄主内源非编码RNA的研究较少,弄清这个问题将有助于解析该病毒的致病机理。本论文拟利用小RNA测序方法,基于生物信息学,以载体构建、RT-qPCR、qPCR技术分析TbCSV及其卫星TbCSB侵染本氏烟时高表达的sly-miR482a参与病毒侵染的过程,希望从miRNA角度揭示TbCSV/TbCSB与本氏烟寄主的互作关系,为进一步解析病毒致病机理及寄主抗性奠定基础。为深入研究sly-miR482a在受TbCSV/TbCSB侵染的本氏烟中的时序性表达,在病毒接种后1～25 d,利用qPCR和RT-qPCR分别检测了病毒的积累量和sly-miR482a的相对表达量。研究表明,TbCSV/TbCSB接种后,在1～20 dpiTbCSV和TbCSB的含量呈逐步上升趋势,在20 dpi时TbCSV和TbCSB的积累量达到最高峰值,后期积累量趋于稳定。在3 dpi时,sly-miR482a表达下调,且在5 dpi显著下调;10 dpi sly-miR482a显著上调;在15 dpi,sly-miR482a显著下调;20 dpi和25 dpi,sly-miR482a上调。相关性分析发现,TbCSV的绝对积累量与sly-miR482a的相对表达量无显著的线性相关性,但是TbCSB的绝对积累量和sly-miR482a的相对表达量有非常强的线性相关性,R~2达到了0.80。为明确sly-miR482a沉默和过表达对本氏烟生长发育和TbCSV/TbCSB侵染的影响,以p GD载体构建了sly-miR482a的瞬时沉默和过表达载体,以PVX载体构建了sly-miR482a的系统沉默载体。瞬时沉默sly-miR482a,TbCSV积累量较对照组极显著升高,TbCSB积累量增加但是没有显著变化;瞬时过表达sly-miR482a,TbCSV积累量较对照组极显著降低,TbCSB积累量也显著降低。症状观察发现,PVX介导系统沉默sly-miR482a的植株表现出叶片凹凸不平、叶面斑驳的症状,沉默sly-miR482a能促进TbCSV和TbCSB的积累。为明确sly-miR482a的靶基因,利用小RNA测序、网站预测、PCR扩增,得到7条预测靶基因;经过RT-qPCR和荧光载体构建实验初步鉴定到sly-miR482a的两个潜在的靶基因,Niben101Scf02248g00001.1和Niben101Scf10767g03011.1。TRV介导两个靶基因的沉默发现下调表达这两个靶基因能降低病毒的积累量,这两个靶基因与sly-miR482a呈现相反的作用模式,表明sly-miR482a调控这两个靶基因参与对病毒积累量的调控。本研究中,小RNA测序分析表明TbCSV/TbCSB侵染本氏烟能诱导sly-miR482a相对表达量的变化,上调表达sly-miR482a和下调表达靶基因能抑制病毒积累量,下调表达sly-miR482a和上调表达靶基因能促进病毒积累量的增加。这些研究结果可为解析TbCSV及其伴随卫星与寄主相互作用的分子机制及寄主抗病机制提供科学依据。
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