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急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（Acute Lung Injury/Acute RespiratoryDistress Syndrome,ALI/ARDS）,是临床常见急性呼吸衰竭的两个阶段,主要表现为肺泡毛细血管屏障破坏,以及肺泡腔内高蛋白性水肿。有研究发现40%的肺损伤患者在插管后12小时内能部分吸收水肿液,说明30%～40%的患者尚存在肺泡上皮细胞主动清除液体的功能,可作为评价肺泡上皮完整性和功能的指标之一,并与ARDS存活率有明显相关。研究早期肺泡上皮细胞清除功能,对肺水代谢过程中ALI/ARDS的转归有重要意义。肺泡Ⅱ型细胞虽然只占肺泡表面积5%,但数量占到了60%,功能有液体转运;富含板层小体分泌表面活性物质;肺损伤时增生转化为Ⅰ型细胞等。本实验着重研究液体转运功能。Ⅱ型肺泡上皮细胞基底侧膜的Na+-K+-ATP酶将钠离子泵出至间质,造成细胞内钠离子浓度降低,肺泡腔内的钠离子顺电势差经上皮钠通道进入细胞;水分子在渗透压差的作用下经水通道进入细胞或细胞间质转运。疾病早期肺水肿的肺泡Ⅱ型细胞肺泡水重吸收是修复肺损伤的修复关键一步。水通道在渗透性水通透中起易化作用,使水通过生物膜的速度远远超过弥散速度。但在病理损伤的情况下,尤其是早期水通道蛋白的调节机制尚不十分明确,基于已认识到水通道蛋白具有主动吸收水的作用,也已证实肺组织中存在1、3、4、5、8、9水通道蛋白等6种水通道。但在肺损伤后,水通道蛋白在肺水肿时如何变化尚未研究。因此,我们选择了在肺泡细胞中具有“干细胞”作用、又广泛覆盖于肺泡表面直接面对肺泡液体的肺泡Ⅱ型细胞作为靶目标。前期的工作证明肺泡Ⅱ型细胞也存在AQP1,并明确了各通道在细胞膜上的分布部位;目前以AQP4为主要研究对象,在液体清除中各发挥何种作用,在正常、肺损伤早期及β2受体激动剂药物治疗后是否有通道的表达变化,检测血管外肺水（EVLW）明确肺水肿形成和清除之间液体量差,是否可以早期使用β2受体激动剂,肺水肿减轻程度,为临床治疗筛选药物探索应用指针和效果提供了实验和理论依据。研究方法健康Sprague-Dawley大鼠（南方医科大学实验动物中心提供）,体重190～230克。按随机数字表法将动物分为3组,对照组、油酸制ALI/ARDS肺损伤模型组、β2受体激动剂特布他林气道治疗组,每组20只大鼠,共60只。实验步骤大致如下:油酸ALI/ARDS模型的建立:油酸是一种具有较强毒性的饱和脂肪酸,进入机体后会对肺组织诱发并扩大氧化性肺损伤。是目前公认较好的ARDS模型,（3）腹腔静脉注射油酸0.1ml/kg,30分钟后放血活杀。通过下一步实验HE病理染色、动脉血气分析、EVLW判断大鼠肺损伤的程度,模型是否成功建立。ATⅡ细胞的分离、纯化和鉴定采用改良的胰酶消化法分离肺泡Ⅱ型上皮细胞,用大鼠IgG免疫粘附法纯化细胞,台盼兰测细胞活力,改良的鞣酸染色法和透射电镜鉴定细胞纯度。EVLW的测定:重力法测定EVLW。在静水压和胶体渗透压综合作用下,渗出的液体减去淋巴管转移入血管的部分为血管外肺水。根据公式计算EVLW含量。大鼠肺泡组织AQP-4免疫组化染色。AQP-4在肺泡Ⅱ型上皮细胞m-RNA表达的测定:Trizol提取总RNA,紫外线分光光度仪OD260检测其含量。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测AQP-4mRNA的表达。采用Strom 860图像分析系统行密度扫描,计算AQP4产物与β-actin产物吸光度积分的比例,作为AQP4 mRNA表达水平。研究结果1.动物ALI/ARDS模型的成功建立经腹腔静脉注入油酸0.1 ml/kg后,所有大鼠均在30s-3min内出现明显呼吸加快,浅促,口唇皮肤以及四肢发绀,气管插管内分泌物明显增多的临床表现。气管插管直接呼吸空气情况下,PaCO2明显上升,PaO2/FiO2值符合ALI/ARDS的诊断标准。对照组肺间质及肺泡内无水肿、炎症,肺泡相对干燥。油酸组可见肺间质及肺泡内有小量出血,可见炎性细胞增多;肺泡隔增宽,肺间质渗液明显,肾上腺素能β2受体激动剂气管给药组肺组织损伤评分介于两者之间。2.大鼠ATⅡ细胞的分离纯化方法是可行的,经台盼兰染色对照组细胞活力84.3±3.21%,油酸组83.7±2.96%（图10-11）,电镜下见细胞形态较规则,呈圆形或立方形,表面有很多长短不一的微绒毛,核圆形,胞质着色浅,呈泡沫状。细胞质内含许多线粒体、粗面内质网、高尔基复合体和溶酶体;并可见特征性的嗜锇性板层小体（图12）。电镜下见细胞变性、凋亡甚至崩解,细胞形态相对不规则,表面的微绒毛明显减少,胞核变形,染色质边集,线粒体肿胀,胞浆内各种细胞器明显减少,板层小体排空显著增多而致空泡化并可见到脱落的板层小体（图13、14）;特布他林组细胞形态相对较规则,板层小体略有释放,线粒体等细胞器无明显变化（图22）。3.EVLW的含量损伤模型组明显高于加药组和对照组,肺水肿形成和清除之间液体量差最小为对照组,加药组差值小于模型组,说明在肺损伤早期,就已经存在明显肺泡毛细血管大量渗出,渗出大于重吸收和间质回流,给药组明显提高肺泡上皮液体清除能力。4.正常大鼠肺泡组织AQP4免疫组化染色,正常组AQP4呈弱阳性染色,细胞偶被染成淡黄色（图25、26）,主要分布肺泡上皮细胞形态较园的细胞上,在模型组AQP4呈阳性染色,棕黄阳性颗粒增多、染色强度变大（图27、28）,加药组呈强阳性表现（图29、30）。经过RT-PCR扩增后,AQP4产物与β-actin产物吸光度积分的比例,作为AQP4的m-RNA表达水平,以加药组合成明显增加,其次为模型组,说明ATⅡ细胞核内合成AQP4的m-RNA是增加,加药组可刺激表达增强（见图31、32）。结论1.采用改良的胰酶消化法可以成功分离正常和油酸ARDS大鼠的ATⅡ细胞,用大鼠IgG包被培养皿纯化细胞、鞣酸染色法鉴定细胞纯度简单可行,而透射电镜是鉴定细胞的金标准。2.经腹腔静脉注射油酸建立大鼠ARDS急性模型是一个相对简单而成功率高的方法,大鼠血PaO2显著下降,PaCO2显著上升,肺部出现明显病理改变,上皮细胞的超微结构出现明显坏死早期的表现,血气分析、光镜下肺损伤评分及EVLW油酸组严重程度显著高于对照组,显微镜下肺泡Ⅱ型上皮细胞的数量较对照组无明显减少,但电镜下细胞的超微结构如板层小体排空,线粒体损伤,符合肺损伤及急性呼吸窘迫综合征的诊断标准。3.气道内特布他林给药,从肺脏大体红色、血气分析、病理、肺泡Ⅱ型上皮细胞电镜下形态等结果达不到肺损伤的标准,肺毛细血管渗透性下降,间质水肿减轻,肺泡上皮细胞主动重吸收加强,体现在血管外肺水明显下降,说明肺损伤早期特布他林有治疗效果。4.AQP4存在于大鼠肺泡上皮,尤其Ⅱ型细胞膜。ATⅡ细胞受损明显,其病理改变以坏死为主,但其仍旧具有上调水通道蛋白转运功能,且肾上腺素能β2受体激动剂作用下,可能通过cAMP信号转导机制,cAMP表达增多,促进AQP4胞浆向胞膜转移及细胞核合成AQP4增多,使AQP4在肺泡腔液重吸收发挥了作用,细胞外肺水显著性减少。