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第一章卵巢癌多药耐药中信号通路关键基因的筛选及其与临床预后的分析目的:综合运用生物信息学方法,结合前期研究结果,筛选与卵巢癌多药耐药相关的信号通路关键基因,并分析其与卵巢癌临床病理关系。方法:运用文本挖掘、通路富集和GO分析等生物信息学方法,分析潜在信号通路关键基因及其生物学功能等。采用荧光定量PCR方法检测卵巢37例卵巢癌敏感组织,34例耐药组织中筛查出的9个潜在基因m RNA表达情况;将122例卵巢癌组织蜡块制作成组织芯片,应用免疫组化检测筛选的4个差异基因在卵巢癌耐药及敏感组织中的表达,并分析其与耐药、临床病理及预后相关性。QRT-PCR和WB验证分次顺铂干预的移植瘤组织中RDX和ITGA5的m RNA和蛋白表达。结果:(1)运用Pathway通路富集和GO分析等生物信息学方法并结合前期研究结果,筛选出ezrin(EZR)、radixin(RDX)、moesin(MSN)、isozyme1(PDK1)、ras homolog family member A(RHOA)、SDC1、SDC2、ITGA5、FN1等9个潜在与卵巢癌多药耐药相关的基因;(2)QRT-PCR验证9个潜在耐药相关基因其在卵巢癌组织中m RNA表达,相对敏感组织,在耐药组织中EZR、FN1、MSN、PDK1、RHOA、SDC1基因则分别下调0.65倍、0.62倍、上调1.09倍、1.69倍、1.42倍和1.09倍,差异无统计学意义(P>0.05);ITGA5、SDC2和RDX分别上调2.03倍、2.38倍和5.76倍,差异有统计学意义(P<0.05);(3)免疫组化检测FN1、ITGA5、SDC2和RDX在卵巢癌组织中蛋白表达,其中FN1、ITGA5、RDX和SDC2在铂类药物耐药型卵巢癌中的表达量高于铂类药物敏感型,除SDC2蛋白表达量两组差异不显著(P>0.05),RDX、ITGA5、FN1差异显著(P﹤0.05);(4)在卵巢癌中,RDX蛋白的表达与FIGO临床分期、术后残余灶有关(P﹤0.05);ITGA5蛋白的表达与术后残余灶有关(P﹤0.05);SDC2、FN1的表达量与年龄、FIGO分期、组织学类型、细胞分化、肿瘤残余灶大小、有无淋巴结、腹腔转移均无关(P>0.05);(5)经Kaplan-Meier生存曲线和Cox模型分析,RDX是影响卵巢患者生存预后的独立因素;ITGA5阳性表达患者较其阴性患者总生存率明显下降(P=0.001),但不是影响生存预后的独立因素。结论:我们通过整合生物信息学、前期蛋白质组学及代谢组学筛选出了与卵巢上皮癌耐药相关重要信号传导通路,并通过QRT-PCR、免疫组化、蛋白印迹等方法进一步验证了这些重要信号传导通路上的关键基因与卵巢癌多药耐药及临床病理的关系。RDX、SDC2、ITGA5和FN1可能是卵巢癌多药耐药的信号通路调控基因,同时RDX、ITGA5在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中表达显著高于铂类药物敏感型卵巢恶性肿瘤,且与患者生存预后有相关性,在肿瘤的生长及肿瘤耐药产生过程中发挥重要角色。后期需要进一步研究RDX、ITGA5参与卵巢癌耐药发生的相关分子机制。第二章RDX、ITGA5对卵巢癌SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞多药耐药的生物功能研究目的:构建下调RDX、ITGA5的慢病毒载体并进行鉴定。研究卵巢癌SKOV3耐顺铂细胞(SKOV3-GFP/DDPⅡ)中RDX、ITGA5基因表达下调后,细胞生物学功能的改变。方法:(1)筛选干扰效率最高的RDX、ITGA5 sh RNA病毒颗粒,感染SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞,QRT-PCR和WB检测感染后细胞中RDX、ITGA5的表达。(2)CCK8法测定细胞的生长、增殖情况、及DDP作用后细胞的半数抑制率的变化;(3)流式细胞术检测DDP作用48小后对细胞周期分布的变化;(4)Transwell法检测细胞侵袭、迁移能力的变化。结果:筛选干扰效率最高的RDX、ITGA5慢病毒载体,感染SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞后,RDX、ITGA5表达明显下调。实验组细胞(SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi、SKOV3-GFP/DDPⅡ-ITGA5i)与对照组、空白组相比较:(1)顺铂的IC50值明显降低、生长速度明显下降(P<0.05),对顺铂的敏感性增加。(2)顺铂诱导后细胞阻滞于G2/M期,其比例明显增加(P<0.05)。(3)RDX、ITGA5干扰后SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞侵袭、迁移能力均明显下降(P<0.05)。结论:通过下调RDX、ITGA5表达,能显著降低卵巢癌SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞的生长、侵袭和迁移能力,增加对顺铂的敏感性增加;RDX、ITGA5基因下调后顺铂将其细胞阻滞在G2/M期。第三章RDX、ITGA5对卵巢癌SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞多药耐药中凋亡和信号通路的影响及机制研究目的:探索RDX、ITGA5基因下调后在顺铂耐药的卵巢癌SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞中凋亡的变化,以及RAS-PI3K-AKT1信号通路的影响,探索RDX、ITGA5参与卵巢癌耐药的可能途径。方法:流式细胞术检测不同顺铂浓度分别作用48小时诱导四组细胞的凋亡率;使用Path Scan?Antibody Array Kit、免疫蛋白印迹(Western blot)方法检测四组细胞(SKOV3-GFP/DDPⅡ、SKOV3-GFP/DDPⅡ-NC、SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi,SKOV3-GFP/DDPⅡ-ITGA5i)信号通路关键蛋白的表达和变化。结果:(1)四组细胞顺铂1μg/ml诱导三组细胞48小时后,实验组细胞(SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi、SKOV3-GFP/DDPⅡ-ITGA5i)与两组对照组相比较凋亡明显增加;(2)与NC组相比,SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi细胞Smad2和TAK1蛋白表达水平显著降低;P44/42 MAPK(ERK1/2)、Akt、Bad、HSP27、p53、SAPK/JNK、PARP、Caspase-3、Caspase-7、Chk1、Ik Ba、EGFR/Erb B1、HER2/Erb B2、HER3/Erb B3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、Ins R、Trk A/NTRK1、Trk B/NTRK2、Met/HGFR、Ron/MST1R、Ret、c-Kit/SCFR、Akt/PKB/Rac和蛋白表达水平显著上调(P<0.05);(3)与NC组相比,SKOV3-GFP/DDPⅡ-ITGA5i细胞EGFR/Erb B1、HER2/Erb B2、FGFR1、Trk A/NTRK1、ALK、P44/42 MAPK(ERK1/2)、Akt、Bad、HSP27、p53、p38 MAPK、SAPK/JNK、PARP、Caspase-3、Caspase-7、Ik Ba、Chk1、Ik Ba、Eph B4和Akt/PKB/Rac蛋白表达水平显著上调;IGF-IR蛋白表达水平显著下调(P<0.05);(4)RAS-PI3K-AKT1信号通路中,SKOV3-GFP/DDPⅡ-RDXi细胞的AKT、MEK1/2、Erk1/2蛋白表达显著上调,Ras表达量下调。结论:RDX、ITGA5基因下调能在SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞中增强顺铂诱导产生的凋亡。RDX下调通过激活抑癌基因P53活性,激活PI3K/Akt通路、Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,从而增加耐药细胞对顺铂的敏感性,为卵巢癌MDR中信号转导通路机制研究提供新的思路。