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目的:地方性氟中毒是人群在长期过量摄入氟而导致的慢性全身性疾病,是我国重点防治的地方病之一。过量摄入氟化物可造成骨转换障碍,从而导致氟骨症。成骨细胞的异常增殖和活化在氟骨症的骨转换障碍中起到关键作用。本研究在既往发现CDK4高表达参与氟骨症成骨细胞增殖活化基础上,结合课题组前期高通量测序结果,采用生物信息学软件预测氟暴露人群中差异表达并靶向调控CDK4的miRNA,在人群和体外两个水平分析筛选出的miR-122-5p与CDK4表达、氟暴露、成骨细胞增殖活化之间的关联,探讨miR-122-5p靶向调控CDK4在氟诱导人成骨细胞增殖活化中的作用。这项研究旨在探讨miRNA在氟骨症发生发展中的作用,并为预防和治疗地方性氟中毒提供新的思路与方向。方法:1.依据地方性氟中毒病区划分标准（GB 17018-2011）,选择贵州省燃煤污染型氟中毒病区织金县荷花村为调查点,非氟中毒地区安顺市双堡镇张官村作为对照点。依据病例及对照纳入标准,追踪既往调查对象共248人,并在知情同意原则下收集调查对象血样、尿样及发样。采用氟离子选择电极法测定尿氟（UF）及发氟（HF）含量,根据所测得的UF浓度,将调查对象分为3组:（1）UF<1.96 mg/g Cr组,117例;（2）1.96 mg/g Cr≤UF<3.92 mg/g Cr组,65例;（3）UF>3.92 mg/g Cr组,66例。根据所测得的HF含量,将调查对象分为4组:（1）HF<0.78μg/g组,60例;（2）0.78μg/g≤HF<1.49μg/g组,63例;（3）1.49μg/g≤HF<3.86μg/g组,63例;（4）HF≥3.86μg/g组,62例。使用miRWalk3.0数据库的四种不同算法（miRwalk、miRDB、miRTar Base和Target Scan）预测靶向CDK4的miRNA。结合课题组前期的miRNA-seq结果,基于三个标准选择了候选的miRNA:miRNA测序结果中下调且差异表达的miRNA（P≤0.05 and|log2FC|≥1）;候选miRNA至少是由两种算法中取交集得到;结合位点为3’UTR。采用微量酶标法和免疫吸附试验法（ELISA）法分别检测248例调查对象碱性磷酸酶（ALP）活力和骨钙素（BGP）含量。采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测miRNA表达;采用q RT-PCR检测CDK4m RNA表达;采用ELISA法检测CDK4蛋白表达。2.酶消法分离人原代成骨细胞,通过形态观察、碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定人原代成骨细胞。以0、200、400、600、800、1000、1200、1400及1600μmol/L氟化钠（Na F）处理人成骨细胞24、48、72及96小时,CCK-8法检测染氟人成骨细胞代谢活力,根据CCK-8实验结果选择0、600、1200μmol/L Na F三个剂量组处理人成骨细胞72小时进行后续试验;流式细胞术检测细胞周期分布;微量酶标法检测ALP活性;ELISA法检测BGP含量;q RT-PCR检测miRNA的表达及CDK4 m RNA表达;采用免疫印迹法（Western-blotting）检测CDK4蛋白表达。3.双荧光素酶报告基因实验验证miR-122-5p与CDK4的靶向结合;miR-122-5p mimic和mimic NC转染人成骨细胞24小时后,使用1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72小时,采用q RT-PCR检测miRNA表达及CDK4 m RNA表达;Western blotting检测CDK4蛋白表达;CCK-8法检测人成骨细胞细胞代谢活力;流式细胞术检测细胞周期分布;微量酶标法和ELISA法分别检测ALP活性和BGP含量。结果:1.基于课题组前期miRNA-seq结果和筛选标准,利用生物信息学软件在下调的miRNA中获得了靶向CDK4的miR-122-5p来进行后续实验。结果显示在燃煤型氟暴露人群中,分别与低UF组和低HF组比较,高UF组和高HF组ALP活力和BGP含量增加（P均<0.05）,提示在本研究氟暴露人群中观察到了氟诱导的成骨细胞活化;分别与低UF组和低HF组比较,高UF组和高HF组miR-122-5p表达降低（P<0.05）,CDK4 m RNA转录及蛋白表达增加（P均<0.05）。同时,研究对象miR-122-5p与CDK4表达呈负相关(rm RNA=-0.379,P<0.05;r蛋白=-0.630,P<0.05),提示miR-122-5p可能参与了CDK4的上调。2.在氟化钠处理的人成骨细胞体外实验中,随着染氟剂量的增加,处于S期和G2/M期的原代人成骨细胞比例增加,G0/G1期的细胞比例减少,增殖指数（PI）、ALP活力及BGP含量逐渐升高（P均<0.05）,表明Na F促进成骨细胞周期由G1期进入S期,导致成骨细胞异常增殖和活化。随染氟剂量的增加,miR-122-5p表达逐渐降低（P<0.05）,CDK4基因m RNA转录及蛋白表达逐渐增加（P均<0.05）,表明Na F可下调人成骨细胞miR-122-5p表达,上调CDK4表达,结果与氟暴露人群中观察到的结果一致。3.双荧光素酶报告基因实验结果证实miR-122-5p与CDK4 3’-UTR直接结合,CDK4是miR-122-5p的靶基因。在转染miR-122-5p mimic的人成骨细胞中,相比于阴性对照组,miR-122-5p表达增加（P<0.05）,表明转染成功。转染miR-122-5p mimic的成骨细胞与只经1200μmol/L Na F处理的成骨细胞相比,miR-122-5p的表达升高（P<0.05）,CDK4蛋白表达降低（P<0.05）,CDK4 m RNA表达无明显变化（P>0.05）;在G0/G1期的人成骨细胞比例升高,而处于S期和G2/M期的细胞比例下降,PI、ALP活力及BGP含量降低（P均<0.05）。结果表明,在Na F作用下,miR-122-5p过表达使成骨细胞CDK4蛋白表达下调,但对m RNA水平无影响,提示miR-122-5p通过抑制CDK4蛋白翻译降低了成骨细胞中CDK4的表达,进而抑制了Na F对人成骨细胞的增殖活化的作用。结论:本研究综合体内外实验结果,可得到以下结论:（1）氟暴露可诱导miR-122-5p低表达。（2）miR-122-5p通过调控CDK4参与氟所致的成骨细胞增殖活化。（3）miR-122-5p直接结合于CDK4 3’-UTR影响其蛋白表达。