背景:目前,中国正在逐步迈入老龄化社会,失能、半失能的具有神经退行性变化的老人数量急剧增加,给社会和家庭带来极大的负担,因此对如何延缓衰老以及阻止衰老导致的神经退行性疾病的研究已成为当务之急。阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）是神经退行性疾病中最常见的类型,约占所有痴呆病例的60%-70%,AD的临床特征是记忆丧失和进行性神经认知功能障碍,随后可引起语言和视觉功能障碍,通常伴有行为失常,导致失去正常生活能力。AD的病因涉及个体遗传、生存环境的共同作用,引起AD的发病机制还不完全清楚,探究AD发病的新机制对研发其治疗药物具有重要意义。细胞衰老是一个由多因素应激信号调控的复杂过程,p53作为重要的抑癌基因,亦是参与调控老化与衰老的关键分子,其可通过调控下游促衰老分子p21介导细胞周期阻滞致使衰老的发生。此外,p53的激活通过调节活性氧、m TOR信号、线粒体和自噬等途径影响器官的衰老以及参与AD的病理进程,但其具体分子机制仍未完全阐明。苏木化（SUMOylation）修饰是一种重要的翻译后修饰（Posttranslational modifications,PTMs）类型,其可以通过改变底物蛋白的亚细胞定位、稳定性、转录调控及蛋白间的相互作用关系对蛋白的功能进行精细的调控。目前研究表明,苏木化修饰参与神经元分化、突触形成、递质释放、囊泡循环和细胞存活等生理过程,其亦可通过介导AD关键发病分子的苏木化修饰在AD的病理进程中发挥重要作用。脑老化的重要表现是神经退行性病变,如神经元数量减少,树突和轴突长度以及数量减少,核蛋白移位,突触后密度、树突棘、突触前标记物以及皮质体积的显著减少。然而,老化以及老化过程中出现神经退行性变化的具体分子机制尚不清楚。有研究报道了p53可以发生苏木化修饰,而然在神经系统中p53的苏木化修饰是否介导了神经细胞的衰老以及神经退变的发生尚无相关研究。因此,研究并明确p53的苏木化修饰参与老化/衰老以及AD发病的分子机制,将进一步阐明神经退行性疾病的发生发展规律,为其临床干预提供分子靶点。目的:明确p53的苏木化异常修饰与细胞衰老和AD病变的相关性,阐明p53苏木化修饰促进其与SET复合物形成障碍,致SET异常转位滞留于胞浆,导致Tau异常过度磷酸化与神经退变发生的机制。为老化过程中AD的发病提供新线索,为临床药物筛选提供新的分子靶标。方法:分析年轻的2月龄小鼠与老龄的18月龄小鼠脑片的p53表达水平,采用免疫组化技术观察脑片中p53的表达分布,采用免疫印迹技术检测海马组织中p53蛋白与SUMO1以及SUMO2/3的表达水平。采用免疫共沉淀技术比较年轻小鼠与衰老小鼠海马中p53的苏木化修饰水平。分离大鼠原代神经元,用Aβ处理,采用CCK8检测细胞存活,采用免疫印迹技术检测SUMO1以及SUMO2/3的表达水平,检测p53下游p21的表达水平。采用β-gal染色与免疫印迹技术检测p16表达水平,分析细胞衰老状态。用Aβ处理N2a细胞,采用免疫印迹技术分析细胞衰老状态,采用免疫共沉淀技术检测p53的苏木化水平。在HEK293细胞与N2a细胞中共同瞬时转染Flag-p53质粒与Myc-SUMO1质粒,用免疫共沉淀技术检测p53的苏木化修饰水平,用免疫印迹技术检测Tau的磷酸化水平与细胞衰老水平。构建p53的苏木化修饰缺陷型Flag-p53 K386R质粒,在N2a细胞中用Flag-p53或Flag-p53 K386R质粒转染细胞,再用Aβ处理细胞,检测下调p53的苏木化对Aβ诱导的Tau蛋白过度磷酸化与细胞衰老的影响,采用免疫共沉淀技术检测p53与SET的结合水平。分离胞浆胞核,检测p53的苏木化修饰对SET出核的影响。用放线菌酮（CHX）处理细胞,检测p53的苏木化修饰对其降解的影响。APP/PS1小鼠海马CA1区脑立体定位注射p53或苏木化修饰缺陷型p53 K386R病毒,注射Vector病毒作为对照。病毒表达4周后通过旷场、高架十字迷宫、新事物识别与水迷宫检测小鼠行为学变化。免疫印迹实验检测小鼠海马中突触前蛋白与突触后蛋白的表达,高尔基染色检测小鼠海马CA1区突触数量的变化,q PCR检测小鼠海马炎症因子的表达。RNA测序检测干预p53的苏木化异常修饰对海马组织内基因表达水平的影响。结果:与年轻小鼠相比,老龄小鼠海马中p53的表达水平明显上调,且p53的苏木化修饰水平升高。在用Aβ处理的原代神经元中,SUMO1的表达水平上调,p53和SUMO2/3的表达水平未改变,p53的SUMO1苏木化修饰水平明显升高,细胞出现衰老表型。Aβ处理的N2a细胞中,p53的Ser15位点磷酸化水平上调,p53的SUMO1苏木化修饰水平明显升高,p21和p16的表达水平升高,细胞出现衰老表型。在N2a细胞中共转染p53与SUMO1,增加了Tau的磷酸化水平与细胞衰老水平。转染p53而非p53的苏木化修饰缺陷型Flag-P53 K386R,促进了Aβ诱导的Tau蛋白过度磷酸化、p53的Ser15位点磷酸化与细胞衰老。用Aβ刺激N2a细胞,转染可被苏木化修饰的p53后其与SET的结合水平减少,下调p53的苏木化修饰后p53与SET的结合水平增加。p53的苏木化修饰使SET在胞核分布降低,胞浆分布增多。CHX结果表明,p53的苏木化修饰未影响其降解。行为学结果表明,与对照比较,注射p53病毒组小鼠焦虑水平明显升高,认知能力明显降低,注射苏木化修饰缺陷型p53 K386R病毒组焦虑水平降低,认知功能改善。免疫印迹实验与高尔基染色实验表明注射p53病毒组小鼠海马CA1区突触数量与海马突触蛋白表达降低,注射苏木化修饰缺陷型p53 K386R病毒组小鼠海马CA1区突触数量与海马突触蛋白表达未受损。q PCR结果表明,干预p53的苏木化修饰抑制了小鼠海马炎症因子的表达。RNA测序结果表明干预p53的苏木化异常修饰减轻了神经发生障碍。结论:在衰老小鼠的海马中,p53的苏木化修饰呈高表达;AD关键致病分子Aβ处理诱导原代神经元与N2a细胞p53苏木化修饰水平升高,细胞呈现衰老状态。p53的苏木化修饰可促进Aβ诱导的Tau的过度磷酸化;p53的苏木化修饰通过降低p53与SET的结合,引起PP2A抑制剂SET进入并滞留胞浆,促进Tau的过度磷酸化与细胞衰老。p53的苏木化修饰促进APP/PS1小鼠认知功能障碍与突触损伤,下调p53的苏木化减轻APP/PS1鼠认知功能障碍与神经炎症。本研究结果初步明确p53的苏木化修饰促进衰老,诱导Tau病变及突触与认知功能障碍,为AD的发病机制提供新的线索。背景:阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）是一种以记忆丧失和进行性认知障碍为特征的神经退行性疾病。目前,全球痴呆症患病人数约为4700万,预计到2050年,这一数字将增加两倍以上。AD的两大重要病理学特征是主要由淀粉样蛋白-β（Aβ）构成的老年斑（SP）,以及异常高度磷酸化Tau蛋白构成的神经原纤维缠结（NFTs）。Aβ42及其相关Aβ肽生成与清除的不平衡导致了细胞外Aβ的异常积累,可致海马区长期突触和记忆损伤。此外,暴露于Aβ42环境下也可触发培养神经元中AD相关表位Tau蛋白的过度磷酸化。淀粉样前体蛋白剪切酶1（Beta-site APP cleaving enzyme 1,BACE1）是一种单次跨膜的天冬氨酸蛋白酶,负责淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein,APP）的剪切产生APPβ,是APP加工过程中的限速酶,因此在Aβ的生成中发挥重要作用。对BACE1的抑制已成为AD治疗药物中降低Aβ毒性的一种有前景的策略。由于AD的病因是多因素的,通常含有多种协同作用成分的天然产物有利于AD的治疗,其有较好的生物可利用性和相对较少的副作用。党参（Codonopsis pilosula,CP）是一种历史悠久的中草药,其成分复杂,包括多糖、倍半萜、皂苷、多酚甙、聚乙炔、生物碱、精油、植物甾醇等。党参多糖（Codonopsis pilosula polysaccharides,CPPs）是从CP中提取的活性化合物,经鉴定具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、免疫增强等多种药理作用。有报道称,硫酸肝素多糖与BACE1相互作用并调控其APP切割活性,主要通过阻断底物与其活性位点的结合。以往的研究也表明,天然多糖可减轻AD动物模型的认知缺陷。然而,CPPs是否能减轻AD的病理变化,特别是Aβ的积累,目前尚不清楚。目的:我们之前的研究表明,CPPs可减轻过表达Tau小鼠中的Tau过度磷酸化和认知障碍。在本研究中,我们探究了CPPs处理对APP/PS1小鼠Aβ毒性以及认知功能障碍的改善作用。方法:用灌胃给药的方法给与APP/PS1小鼠不同浓度的CPPs处理1个月,用行为学方法检测小鼠的焦虑样行为以及认知功能。用蛋白免疫印迹检测处理后小鼠海马组织突触相关蛋白、Aβ生成通路相关蛋白的表达以及BACE1的酶活性。在体外使用细胞模型N2a-APP与HEK293瞬转APP的细胞,不同浓度的CPPs处理,检测BACE1的表达水平与活性。在体外用不同浓度的CPPs与重组BACE1酶共孵育,检测CPPs对BACE1活性的影响。结果:在本研究中,我们发现CPPs灌胃1个月后明显改善了APP/PS1小鼠的认知功能障碍,减轻了海马内突触可塑性的丢失,并增加了突触相关蛋白Synaptotagmin和PSD95的表达。此外,治疗组海马组织中BACE1酶活性降低,Aβ40与Aβ42表达显著降低。在体外培养的细胞中,CPPs与细胞共孵育抑制了细胞内BACE1的活性。在体外用不同浓度的CPPs与重组BACE1酶共孵育,结果表明CPPs对BACE1的活性有明显的抑制作用。结论:综上所述,这些结果表明CPPs下调BACE1活性可能是缓解AD病理与认知障碍的潜在机制。