辣椒再生体系的建立及FaNES1基因转化辣椒

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辣椒抗虫基因工程发展的最大障碍是辣椒离体再生困难,以致转化率太低。本研究以6个辣(甜)椒品种为试材,分别就基因型、外植体类型、苗龄、培养基成分等对辣椒离体再生的影响进行了较为系统的探讨,建立了辣椒的再生体系。在前人研究的基础上,通过对外源基因转化辣椒的转化培养条件的摸索,建立辣椒的遗传转化体系。通过农杆菌介导的方法将FaNES1导入辣(甜)椒,经过PCR检测,初步证实目的基因已整合到辣椒基因组中。主要结果摘要如下:1不同的辣(甜)椒品种在不同的培养基中其分化频率有较大差别。其中IAA0.5mg/L+6-BA 5mg/L对苏椒五号和Shakira的诱导频率最高,分别达到89.34%和82.37%;IAA 0.5mg/L+6-BA 6mg/L对Dallas的诱导频率最高,达74.16%;IAA 0.8mg/L+6-BA 5mg/L对Fiesta的诱导频率最高,达73.06%;IAA 0.8mg/L+6-BA 4mg/L对Polara的诱导频率最高,达70.06%;IAA1.0mg/L+6-BA 5mg/L对Olympus的诱导频率最高,达65.98%。。2培养基中添加AgNO3对辣(甜)椒外植体不定芽的诱导与伸长都没有影响;但是能有效地抑制外植体培养过程中的褐化现象。3 GA3的添加有利于不定芽的伸长,但是抑制不定芽的分化。不定芽的伸长频率随着GA3浓度的增加而增加,但当GA3浓度增加到3.0 mg/L时反而抑制不定芽的伸长,GA3的适合浓度为1.0~2.0 mg/L,能有效的促进不定芽的伸长。4在培养基中添加6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L)与IAA(0、0.2、0.5 mg/L),或ZT(0.5、1.0 mg/L)与GA3(0、0.5、1、1.5、2.0、3.0 mg/L)进行配组,结果表明Zt1.0mg/L+GA32.0mg/L对不定芽伸长效果最好。5设置卡那霉素(km)浓度为0mg/L、70~110mg/L,结果表明110mg/L的Km可完全抑制苏椒五号不定芽分化。6农杆菌感染前辣椒转化外植体进行预培养,感染后共培养及共培养后的延迟培养有利于子叶遗传转化效率的提高,在预培养阶段设置1d,2d,3d,4d,延迟培养设置0~4d,结果显示共培养最佳时间分别为2d,延迟培养的时间也为2 d。7在转化苗的生根阶段,Km明显的抑制根系的生长,选择不使用Km进行筛选为宜。8将橙花叔醇合酶基因FaNES1转化辣椒,得到转化植株。对部分转化植株提取DNA,经PCR检测,初步证明目的基因已整合到辣椒基因组中。
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