背景:目前,神经胶质瘤的治疗原则是手术治疗,同时辅以放化疗,化学治疗仍是神经胶质瘤的主要治疗手段之一。替莫唑胺(TMZ)是神经胶质瘤的一线化疗药物,但是由于药物敏感性随治疗过程逐步下降,TMZ治疗可以延长胶质母细胞瘤中位生存期3-5个月。因此,如何增加神经胶质瘤细胞TMZ敏感性成为影响化疗效果的瓶颈问题。既往研究发现,在TMZ干预下,自噬起到促死亡和促存活两种看似相悖的作用,但是其潜在机制尚不明晰,为精准判断自噬在治疗中的作用并靶向自噬提高TMZ疗效带来了困难。目前研究已经表明,许多自噬相关蛋白参与凋亡调控,自噬流状态被认为是决定自噬作用的关键因素。因此,在不同自噬流背景下,探讨自噬在凋亡调控及TMZ敏感性调节中的作用,为靶向自噬提高TMZ敏感性,提高胶质瘤患者生存期提供理论依据。自噬(Autophagy)是一个高度动态,多步骤的生物进程,包括起始,自噬膜形成与延伸,自噬体成熟闭合,与溶酶体融合以及溶酶体降解。自噬的这一完整过程称之为自噬流(Autophagic Flux),用来反应自噬水平的高低。既往研究证明,TMZ作用下,在不同步骤干扰自噬流会导致不同的细胞命运,提示TMZ作用下,自噬流状况决定的自噬底物的堆积状态可能是决定自噬促生存或促死亡作用的关键因素,进而决定细胞命运。SQSTM1,也叫做p62,是选择性自噬的特异性底物,也是自噬体膜的重要组成成分。实验室早期研究发现,p62的基础性高表达和通畅的自噬流赋予肿瘤细胞对治疗更高的耐受性。当应用氯喹(chloroquine,CQ)或巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf A1)在自噬流晚期阻断自噬流后,凋亡敏感性显著升高。同时,敲除ATG4C基因可有效阻断自噬流量,导致p62和LC3-II的堆积性表达增高,增加TMZ的细胞毒性作用。这些证据提示,p62作为关键蛋白决定自噬的促生存或促死亡作用。但是,单纯依靠p62的表达并不能准确反映自噬流状态以及鉴别自噬在TMZ诱导细胞死亡中的作用。因此,在不同自噬流背景下,揭示p62在TMZ诱导的细胞死亡中的作用机制是一个亟需解决的任务。研究提示,p62可通过介导Caspase-8激活或降解影响细胞命运。Caspase-8作为外源性凋亡途径中的关键蛋白,尽管其在GBM中表达上调,但是其凋亡活性并未激活。由此,激活Caspase-8的凋亡活性可能是一个提高TMZ敏感性的有效策略。而自噬体膜可作为细胞内死亡诱导信号复合体(i DISC)平台,进而导致不依赖于死亡受体的Caspase-8激活。因此,从i DISC的形成与降解角度探究Caspase-8与p62的相互作用可能有利于揭示自噬流对凋亡的精确调控机制,提供一个精准判断TMZ作用下自噬作用的参考指标。本研究以不同自噬流量的SHG44和U87MG胶质瘤细胞系为研究模型,利用胶质瘤组织芯片、细胞模型及裸鼠皮下异体移植瘤模型,采用免疫共沉淀、间接免疫荧光等分子生物学技术,探讨自噬流量调节i DISC形成与降解影响自噬在TMZ治疗中的作用,为精准靶向自噬,提高TMZ敏感性,改善患者预后提供理论基础。方法:(1)利用生物信息学大数据及胶质瘤组织芯片分析胶质瘤级别与p62和Caspase-8表达之间的关系,结合对应的临床资料,分析p62及Caspase-8对患者预后影响。(2)利用MTT法检测TMZ,CQ对胶质瘤细胞的细胞活性抑制情况;(3)Western Blotting检测p62和LC3表达,m RFP-GFP-LC3双标腺病毒感染细胞评价自噬流量。(4)利用Caspase-8和Caspase-3活性检测试剂盒,TUNEL法、Annexin-V/PI双染、Western Blotting检测凋亡蛋白来检测TMZ和CQ诱导的凋亡发生情况。(5)利用间接免疫荧光及免疫共沉淀来检测p62、Caspase-8之间的空间共定位以及自噬体膜对Caspase-8的招募情况。(6)通过p62敲除、过表达p62及UBA和LIR截短突变体,检测Caspase-8活性并使用Western检测蛋白剪切情况,评价p62及其结构域对Caspase-8活化的影响。(7)利用裸鼠胶质瘤皮下异体移植瘤模型,给予TMZ灌胃,CQ腹腔注射处理,体内验证CQ与TMZ的联合作用;检测处理后异体移植瘤的p62、Caspase-8的表达及活性变化。结果:(1)生物信息学及胶质瘤组织芯片结果显示,自噬及溶酶体相关基因在胶质瘤中高表达,自噬特异性底物p62和Caspase-8的表达具有相关性,且p62高表达的情况下,Caspase-8高表达的患者预后较好。(2)筛选出低自噬流量的SHG44和高自噬流量的U87MG,替莫唑胺显著提高胶质瘤细胞的自噬起始及自噬流量。CQ阻断自噬流量后,p62显著堆积性表达增高,同时增加替莫唑胺诱导的Caspase-8活化以及凋亡。(3)CQ阻断自噬可增加p62和Caspase-8的相互作用以及自噬体膜对Caspase-8的招募。敲除p62降低TMZ和CQ联合应用导致的Caspase-8活化。p62过表达可增加TMZ诱导的Caspase-8活化。而与野生型p62相比,UBA和LIR结构域截短突变体显著抑制了Caspase-8的活化。(4)体内实验证明CQ有效增加TMZ对肿瘤生长的抑制。CQ增加异体移植瘤的p62堆积和Caspase-8活化。结论:(1)高级别胶质瘤的基础自噬流量显著高于低级别胶质瘤,并且较高的基础自噬流量预示着不良预后。(2)阻断自噬流或自噬起始大于自噬相关溶酶体降解能力将导致p62的堆积,进而介导Caspase-8激活。自噬流量调控i DISC的形成与降解,调控Caspase-8活化,进而参与胶质瘤对替莫唑胺的敏感性调节。(3)i DISC介导的Caspase-8激活依赖于p62的UBA和LIR结构域。(4)Caspase-8可辅助p62判断胶质瘤自噬流量的大小;p62/Caspase-8表达模式具有成为更精准的胶质瘤预后指标的可能。