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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是导致痴呆的最主要病因,约占痴呆患者总数的60-80%。继心脏病、癌症和脑卒中之后,AD已成为工业社会的第四大死因。该病不仅带来了严重的社会问题,而且对经济社会的发展造成了沉重的负担。AD最重要的病理学特征是脑内内侧颞叶和皮层等区域出现淀粉样斑块(老年斑)沉积和过度磷酸化tau蛋白形成的双螺旋状神经元纤维缠结。尽管AD的发病原因尚无定论,但许多基因和病理学证据支持淀粉样斑块的主要成分淀粉样β肽(amyloid-β,Aβ)是AD最重要的致病因子之一。Aβ通过聚集引发神经元纤维缠结形成、细胞内氧化压力升高、突触损伤、炎症反应和神经细胞退化等一系列病变,最终导致病人表现出痴呆症状。健康人体内存在Aβ单体并有其正常的生理功能,但外界及病人体内多种因素的改变都有可能引起Aβ发生聚集从而产生毒性。与PM2.5污染相关的流行病学和毒理学研究指出,PM2.5上吸附的多种金属离子可能是导致Aβ发生聚集的危险因素。近年来PM2.5及其组分诱发神经退化的机制已经成为研究的热点,鉴于此,本论文首先选择了PM2.5吸附物中常见的7种金属离子,从体外聚集动力学、形态结构和细胞毒性等方面重点考察金属离子对Aβ聚集和细胞毒性的影响。另外,小分子抑制剂姜黄素和蛋白类抑制剂人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)能够缓解Aβ引起的神经损伤,但它们对Aβ聚集的影响效果仍然存在争议。本论文通过进一步建立方法,研究了这两种聚集抑制剂对Aβ聚集不同阶段的抑制过程。希望通过本项目研究提高对Aβ聚集影响因素及聚集抑制剂作用过程的理解和认识,为预防和治疗AD的研究提供参考。论文第二章首先研究了镁(Mg2+)、锰(Mn2+)、镍(Ni2+)、铬(Cr2+)、钴(Co2+)、铅(Pb2+)和铜(Cu2+)离子对Aβ40聚集动力学、聚集体结构和细胞活性的影响。发现虽然同是二价金属离子,却体现出不同的影响规律。在Aβ40单体的纤维化聚集和纤维生长过程中分别加入上述7种金属离子,发现Ni2+、Cr2+、Co2+、Pb2+和Cu2+能明显抑制纤维的生成和生长。浊度分析和透射电镜检测发现,上述5种金属离子虽然抑制了 Aβ40纤维的生成和生长,但却能够促进Aβ40单体聚集成无定形聚集体。硫磺素T和ANS荧光实验结果说明这5种金属离子主要通过抑制Aβ40形成β片层结构和疏水性结构从而抑制其纤维化聚集。细胞毒性研究表明,上述5种金属离子与Aβ40单体共同处理SH-SY5Y细胞,产生的细胞毒性小于Aβ40纤维生长过程产生的细胞毒性。同时这5种金属离子也能够降低Aβ40纤维生长过程诱发的细胞毒性。相同条件下,Mg2+和Mn2+离子对Aβ40的聚集过程和细胞活性均无明显影响。已有的研究证实,Aβ原纤维和纤维可以作为聚集体种子促进Aβ单体进一步聚集成纤维,并产生更强的细胞毒性。但对于金属离子诱发的非纤维化无定形聚集体在没有金属离子存在的条件下能否作为种子促进纤维化还需进一步研究。因此,论文第三章将第二章金属离子诱发的无定形聚集体提取出来,研究了 Aβ40单体在这些聚集体上的生长行为及其对细胞毒性的影响。实验结果发现:金属离子诱发的非纤维化无定形聚集体在没有金属离子存在的条件下能够引起Aβ40单体在其表面的纤维化聚集生长,在这一过程中产生与Aβ40纤维种子生长类似的细胞毒性。Aβ聚集体的纤维化生长会产生显著的细胞毒性,因此,其纤维化的抑制剂对治疗AD可能会有帮助。论文第四章和第五章分别研究了姜黄素和HSA对Aβ纤维化的影响。第四章中,由于姜黄素对硫磺素T荧光法测定Aβ纤维化有干扰,因此本论文采用带耗散的石英晶体微天平(quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)研究了姜黄素对Aβ40纤维生长过程的影响。结果表明,与对照相比,姜黄素的加入能够促进Aβ40单体沉积在Aβ纤维上,并形成结构更加松散的聚集体,且该种聚集体不利于Aβ40单体的进一步纤维化生长。论文第五章对HSA的研究表明,HSA的加入能够抑制聚集能力更强的Aβ42单体的纤维化过程,也能明显抑制Aβ42原纤维和纤维的进一步生长,其中对原纤维和纤维生长的抑制能力明显高于单体。表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)检测结果表明HSA与Aβ42单体、原纤维、纤维的平衡解离常数(equilibrium dissociation constant,KD)分别为 17.5 μM、3.3 μM、0.3 μM,说明 HSA 与 Aβ42原纤维、纤维的强结合力是抑制纤维生长的重要原因;HSA与Aβ42单体、原纤维、纤维的解离速率常数(dissociation rate constant,kd)分别为 1.2×10-2s-1、0.4X10-2s-1、0.1 X 10-2s-1,说明HSA与Aβ42单体形成的复合物不如与Aβ42原纤维和纤维形成的复合物稳定。进一步研究证实HSA能够以浓度依赖的方式抑制Aβ42纤维化聚集诱发的细胞毒性。通过上述一系列体外实验结果,使我们对金属离子和抑制剂对Aβ的聚集过程及其细胞毒性的影响有了更深入的理解和认识,为未来AD的相关研究提供了参考。