目的:肝移植是治疗终末期肝病的最佳选择,而器官短缺促使心脏死亡(donation after circulatory death,DCD)供肝大量应用于临床。目前最常用也是最方便经济的供肝体外保存方式仍是静态低温冷储存(static cold storage,SCS)。移植前多种原因会导致供肝冷保存时间延长损伤肝脏功能,影响肝移植预后。为此,我们拟通过基因干预手段,探究长时间冷保存对DCD供肝造成损伤的机制,并从动物及细胞水平验证蛋白磷脂酶2A(protein phosphatase 2A)在其中的作用。方法:首先建立大鼠DCD模型获取肝脏,分别冷保存12h及24h,应用体外常温灌注系统评估肝脏功能,并检测PP2A,线粒体分裂蛋白Drp1,内质网应激损伤效应蛋白CHOP以及凋亡标记蛋白caspase3,caspase9,Bcl-2,Bax等的表达变化情况。之后采用AAV8病毒转染及特异性药物抑制剂分别对PP2A及线粒体分裂和内质网应激进行干预,分析长时间冷保存导致肝脏损伤过程中的具体调控机制。并通过RNA测序方式检测PP2A的干预对DCD肝脏中损伤通路的调控情况。结果:(1)RNA测序结果显示DCD肝脏组织中凋亡调控通路表达升高,干扰PP2A使肝脏组织内凋亡调控通路及应激反应通路基因表达下降。(2)长时间冷保存加重DCD肝脏损伤,表现为体外灌注液中ALT、AST指标明显升高,肝脏切片病理损伤评分增加,细胞凋亡增加。蛋白检测显示PP2A,Drp1,CHOP表达升高,凋亡标记蛋白caspases,Bax表达升高。线粒体损伤加重,细胞色素c向细胞质释放增加。(3)干扰PP2A表达缓解了DCD肝脏损伤,表现为损伤评分降低,ALT,AST指标降低,细胞凋亡水平降低。蛋白检测显示PP2A表达降低后Drp1、CHOP表达同样下降,同时凋亡相关标记蛋白caspases表达降低。线粒体损伤及细胞色素c释放减轻。(4)抑制线粒体分裂蛋白Drp1减轻内质网应激水平,抑制内质网应激不影响Drp1的表达。结论:在长时间冷保存造成DCD肝脏损伤的过程中PP2A表达增加使线粒体异常分裂增加,在释放包含细胞色素c在内的损伤因子同时诱发内质网应激,导致肝细胞凋亡损伤肝脏功能。