背景和目的:应激是指机体受到内外环境刺激时的非特异性、全身性的神经内分泌免疫反应,焦虑障碍则是一种常见的由应激导致的情绪障碍疾病。当今社会应激事件、种类的不断增多导致其存在高发病率、低诊断率及低治疗率等问题,严重影响了人民的生活水平。有些个体易被应激影响导致其患病率较高,即易感性(susceptibility);但仍有部分个体在同样的应激水平下并未出现明显的生理及心理变化,即应激弹性或韧性(resilience)。应激弹性是指个体能够从压力与困难中快速恢复和适应的能力,深入研究应激弹性相关的神经生物学机制对疾病的预防以及发现潜在的药物靶点具有重要的研究价值。应激弹性相关的神经机制研究主要集中在杏仁核、扣带回皮层、前额叶皮层、岛叶皮层等区域,其中岛叶皮层(insular cortex,IC)在结构和功能上连接初级和次级感觉区,接收和整合来自其他皮层及皮层下区域的情绪、认知等信息,在情绪疾病及应激弹性中的重要性也逐渐被高度重视。但是目前对于岛叶皮层在应激弹性中的作用尚未明确;岛叶皮层在焦虑障碍应激弹性动物模型中的具体调控机制亟待解决,焦虑障碍造模方法种类较多、结论不一致。因此本课题的研究目的为:1.建立稳定有效的焦虑障碍应激易感与弹性动物评价模型2.探讨岛叶皮层在应激易感与弹性中的神经生物学机制。方法:1.采用单程长时应激(single-prolonged stress,SPS)、束缚应激(restraint stress,RS)、足底电击法(foot shock,FS)建立小鼠焦虑障碍模型,对不同应激源、不同应激天数、不同应激时长下小鼠的行为学进行比较:通过旷场和高架十字迷宫实验评价小鼠焦虑样行为,以期筛选一种简单、有效且稳定的应激弹性动物评价模型,用于后续机制研究。2.采用足底电击法(foot shock,FS)建立应激弹性动物评价模型,对应激前、应激后24h、应激后4周三个时间段的行为学分别进行检测:通过条件恐惧实验评价创伤事件再体验症状,旷场和明暗箱穿梭实验评价主动回避症状,前脉冲抑制实验(pre-pulse inhibition,PPI)评价高觉醒症状,通过分析应激后短期(24h)到应激后长期(4周)小鼠的行为学变化情况,区分出应激易感与弹性小鼠,进行机制研究。3.采用平面微电极阵列技术(Multi-electrode array system,MED64)检测应激易感与弹性小鼠岛叶皮层神经元的突触可塑性变化,进而揭示岛叶皮层与应激易感弹性现象之间的相关神经生物学机制。4.采用立体定位病毒注射技术在小鼠岛叶皮层中分别注射兴奋性和抑制性腺相关病毒以观察激活或抑制岛叶皮层神经元后小鼠的焦虑样行为变化;对病毒注射四周后的小鼠腹腔注射其配体氯氮平-N-氧化物(clozapine,CNO)后的行为学进行检测:通过旷场和高架十字迷宫实验评价小鼠焦虑样行为,进一步验证岛叶皮层在小鼠焦虑障碍中的作用。结果:1、单程长时应激、束缚应激、足底电击致小鼠焦虑障碍模型的筛选为了筛选一种简单、有效且稳定的焦虑障碍动物模型进行后续应激弹性机制的研究,对SPS与RS 2h,连续14天;RS 2h、4h、6h、8h,连续7天;FS应激14天下小鼠焦虑样行为分别进行比较。1.1单程长时应激与束缚应激14天对小鼠焦虑样行为的影响结果显示,与空白对照组相比,应激组小鼠在旷场中央区探索时间均有下降的趋势;高架十字迷宫实验中,单程长时应激组小鼠在开放臂内停留时间有升高的趋势,束缚应激14天组小鼠有降低的趋势,提示单程长时应激与束缚应激14天对小鼠焦虑样行为无明显影响。1.2束缚应激7天对小鼠焦虑样行为的影响结果显示,与空白对照组相比,束缚应激2h、6h、8h,连续7天组小鼠在旷场中央区停留时间有下降的趋势,RS 4h组无明显变化;高架十字迷宫实验中,束缚应激2h、4h、6h,连续7天组在开放臂内停留时间显著下降,RS 8h组有下降的趋势,提示束缚应激2h,4h、6h、8h,连续7天可能诱发小鼠焦虑样行为。1.3足底电击应激14天对小鼠焦虑样行为的影响结果显示,与空白对照组相比,足底电击应激14天组小鼠在旷场中央区停留时间和高架十字迷宫开放臂内停留时间均显著下降,提示足底电击应激14天成功诱发小鼠焦虑样行为。以上行为学结果显示,足底电击应激14天显著增加小鼠焦虑样行为,因此后续选取足底电击应激14天模型进行应激易感与弹性动物的筛选。2、应激易感与弹性动物评价模型的建立应激易感与弹性动物的评价标准为:分别将应激后小鼠在条件恐惧实验中的僵住时间、旷场中的中央区停留时间、明暗箱穿梭中的明箱探索时间、前脉冲抑制实验中的前脉冲抑制率与应激前对应行为学的均值进行比较,表现更焦虑的小鼠定义为该种行为学中的阳性小鼠。如在四种行为学中均表现为阳性症状的记为4,在三种行为学中表现为阳性症状的记为3,以此类推,共有4、3、2、1、0五种症状类型,其中阳性症状≥3的小鼠定义为应激易感小鼠(S,susceptible),阳性症状<3则为应激弹性小鼠(R,resilience)。2.1足底电击对小鼠体重的影响与对照组小鼠相比,足底电击小鼠体重在应激中和应激后无明显差异,但体重变化趋势均为在应激期间缓慢增长,应激后2周之内反而下降,之后3周内缓慢增长,最后趋于平稳,提示足底电击14天使小鼠体重在应激后短期下降更为明显。2.2足底电击后短期小鼠的行为学变化2.2.1足底电击后短期小鼠创伤再体验行为的变化为了观察应激后短期小鼠的创伤再体验行为变化,对应激前与应激后24h小鼠在条件恐惧情景和线索测试中的僵住时间进行检测。结果显示,与应激前相比,应激后24h的情景和线索测试中小鼠僵住时间显著升高,但部分小鼠僵住时间仍与应激前相比无明显变化,即应激弹性。提示足底电击14天可以明显增加小鼠应激后短期的创伤再体验行为,且存在应激弹性现象。2.2.2足底电击后短期小鼠主动回避行为的变化为了观察应激后短期小鼠的主动回避行为变化,对应激前与应激后24h小鼠在旷场中央区探索时间和明暗箱穿梭实验中明箱停留时间进行检测。结果显示,与应激前相比,应激后24h小鼠在中央区探索时间和明箱停留时间均显著减少,两个实验中,均有部分小鼠与应激前相比无明显差异,即应激弹性。提示足底电击14天可以明显增加小鼠应激后短期的主动回避行为,且存在应激弹性现象。2.2.3足底电击后短期小鼠高觉醒行为的变化通过前脉冲抑制实验来检测应激后短期小鼠的高觉醒行为变化。由于该实验测试过程中的声刺激为高强度应激,为了减少对应激后行为测试的干扰,未进行应激前前脉冲抑制实验。在进行前脉冲抑制测试之前,首先对实验小鼠进行输入输出测试,来确定产生震惊反射的声音阂值。结果表明,65～1OOdB的声刺激不会使小鼠出现明显的震惊反射,其中65～80dB阶段震惊幅度较为稳定,大于100dB时震惊反射幅度开始上升,在105～110dB左右出现平台期。鉴于上述结果,在后续测试中采用105dB作为震惊反射的刺激强度,采用小于80dB(不引起小鼠产生震惊反射)的声刺激作为前脉冲刺激强度。结果显示,应激后24h小鼠随着前脉冲刺激强度增加,对震惊反射的抑制率逐渐下降的现象,原因可能是应激小鼠的感觉门控功能受损从而导致前脉冲抑制缺失以致出现高觉醒症状。将前脉冲刺激强度的平均值80dB下每只小鼠的PPI值进行统计,发现依然有部分小鼠表现与对照组相似,即存在应激弹性现象。2.3足底电击后长期小鼠的行为学变化2.3.1足底电击后长期小鼠创伤再体验行为的变化为了观察应激后长期小鼠的创伤再体验行为变化,将应激前与应激后4周小鼠在条件恐惧情景和线索测试中的僵住时间进行比较。结果显示,与应激前相比,应激后4周的情景和线索测试中小鼠僵住时间仍显著升高,但仍有部分小鼠与应激前相比无明显差异,即应激弹性,提示足底电击14天可以明显增加小鼠应激后长期的创伤再体验行为,且依然存在应激弹性现象。2.3.2足底电击后长期小鼠主动回避行为的变化为了观察应激后长期小鼠的主动回避行为变化,将应激前与应激后4周小鼠在旷场中央区探索时间和明暗箱穿梭实验中明箱停留时间进行比较。结果显示,与应激前相比,应激后4周小鼠在中央区探索时间和明箱停留时间均显著减少,两个实验中,均有部分小鼠与应激前相比无明显差异,提示足底电击14天可以明显增加小鼠应激后长期的主动回避行为,且存在应激弹性现象。2.3.3足底电击后长期小鼠高觉醒行为的变化通过前脉冲抑制实验来检测应激后长期小鼠的高觉醒行为变化。结果显示,应激后4周小鼠随着前脉冲刺激强度增加,对震惊反射的抑制率逐渐下降的现象,提示应激后4周小鼠仍存在高觉醒症状。相比于应激后24h,应激后4周小鼠在各分贝下的PPI值均偏高,表明应激后4周小鼠的前脉冲抑制缺失现象较应激后24h减轻,提示应激4周后可能部分小鼠的高觉醒症状减弱。将应激后4周每只小鼠在80dB下的PPI值进行统计,发现仍有部分小鼠表现与对照组相似,即存在应激弹性现象。2.4区分应激易感与弹性动物按易感与弹性动物的评价标准分别将应激后24h和应激后4周的易感与弹性小鼠进行区分,且对每只小鼠在应激后24h至4周的易感与弹性转化情况分为四类:S-S、R-S、S-R、R-R,各占应激动物总数的56%,10%,26%,8%,将这些易感与弹性小鼠进行机制研究。(S,susceptible,易感)(R,resilience,弹性)3、岛叶皮层在应激易感与弹性中的机制研究3.1应激易感与弹性小鼠血浆皮质酮的变化通过放射免疫法将对照组、易感组、弹性组小鼠的血浆皮质酮含量进行检测,发现易感组与弹性组小鼠皮质酮含量对照组相比无明显变化,提示应激后四周小鼠血浆皮质酮已经恢复到正常水平。3.2应激易感与弹性小鼠岛叶皮层突触可塑性的变化通过平面微电极阵列技术(MED64)对易感与弹性小鼠岛叶皮层神经元突触可塑性进行检测,结果显示,与对照组相比,易感小鼠岛叶皮层LTP(long-termpotentiation)显著降低,弹性小鼠则无明显变化,提示应激易感小鼠岛叶皮层突触可塑性损伤,弹性小鼠岛叶皮层突触可塑性无明显变化,岛叶皮层突触可塑性损伤可能是应激易感的机制之一。3.3兴奋或抑制岛叶皮层神经元对小鼠焦虑样行为的影响为了进一步明确岛叶皮层在小鼠焦虑障碍中的作用,采用立体定位技术将腺相关病毒精确注射到岛叶皮层以达到兴奋或抑制岛叶皮层神经元活性的目的。结果显示,与空白对照组相比,兴奋岛叶皮层神经元后小鼠在旷场中央区探索次数和时间有升高的趋势,抑制岛叶皮层神经元后小鼠进入旷场中央区的探索时间和次数均显著降低;高架十字迷宫中,两组小鼠进入开放臂次数和开放臂停留时间均有降低趋势,提示抑制岛叶皮层神经元活性可以诱发小鼠产生焦虑样行为的趋势。结论:(1)在小鼠足底电击模型中区分出应激易感与弹性小鼠,建立了稳定的应激弹性动物评价模型,并发现应激易感小鼠岛叶皮层神经突触可塑性损伤,弹性小鼠岛叶皮层神经突触可塑性无明显变化,提示岛叶皮层突触可塑性损伤可能是应激易感的机制之一;(2)抑制岛叶皮层神经元可以诱发小鼠产生焦虑样行为的趋势,提示岛叶皮层神经元活性减弱可能诱发焦虑行为。综上所述,本研究建立了应激弹性动物评价模型,且发现了岛叶皮层对焦虑障碍的发病起着一定的调控作用,其突触可塑性的损伤可能是机体产生应激易感现象的机制之一,为深入研究焦虑障碍的神经生物学机制提供了一定的实验基础,为提出新的治疗靶点提供了一定线索。