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表皮的鞣化,骨化及黑化在昆虫发育中起着重要作用,3,4-二羟苯丙氨酸(多巴,Dopa)是昆虫新生表皮鞣化和免疫黑化所必需的。酪氨酸在酶的作用下羟化为Dopa,Dopa再在一系列酶的作用下转化为儿茶酚类及其衍生物,并且参与到鞣化与免疫黑化中。酪氨酸羟化为多巴的反应可在两种酶的作用下进行:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH, EC 1.14.16.2)及酚氧化酶(phenoloxidase, PO, EC 1.14.18.1)。TH是芳香族氨基酸羟化酶家族的一员,其所参与的羟化反应需要四氢生物喋呤(BH4)作为辅因子,该反应是儿茶酚胺类及其衍生物生物合成中的第一步也是整个过程中的限速步骤。酪氨酸羟化酶在脊椎动物及无脊椎动物中是高保守的,对果蝇TH及其他昆虫类TH的研究表明TH在昆虫表皮鞣化及免疫防御反应中扮演着重要的角色。目前对昆虫TH的研究主要集中在双翅目及鳞翅目类昆虫,且尤以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)研究较为深入。为获得鞘翅目昆虫中TH特性,本文以鞘翅目昆虫黄粉虫(Tenebrio molitor)为研究对象,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术和PCR方法从大肠杆菌免疫注射诱导的黄粉虫末龄成熟幼虫脂肪体中获得了编码黄粉虫酪氨酸羟化酶(TmTH)蛋白的cDNA全长序列2103bp,其中包含可编码534个氨基酸残基的1605bp开放式阅读框,预测TmTH蛋白质分子量为60.66kDa,等电点为5.70 (GenBank登录号:GQ390366)。序列比对分析显示TmTH蛋白序列与其他昆虫类蛋白序列高度保守,与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)同源性高达92.32%,与鳞翅目昆虫及哺乳动物同源性分别达到65.12%及43-47%,且该酶在氮端区域包含一个保守的cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点。氨基酸序列分析显示,TmTH蛋白不存在信号肽,不是一种分泌型蛋白,同时具有芳香族氨基酸羟化酶家族的典型结构特征:四氢生物喋呤结合区、催化区及调控区。为了解TH在黄粉虫中的表达特性及与免疫的相关性,使用半定量RT-PCR方法分析了末龄成熟黄粉虫幼虫中TmTH表达情况,数据显示TmTH mRNA在正常幼虫大脑中大量表达,而在表皮、脂肪体及血淋巴表达量相对较少,这表明该酶可能会参与到黄粉虫幼虫神经活动中,该作用有待于进一步研究。末龄成熟幼虫在灭活大肠杆菌处理后,表皮及脂肪体中TmTH表达量明显增加,且在处理后6-12h内达到最大值,在36h内仍处在较高的表达水平,随后表达量逐渐恢复正常水平,而在脑中TmTH的表达上调不明显。在研究TmTH的诱导表达特异性中发现革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均可诱导TmTH的表达,且无明显差异。为探讨TmTH与表皮鞣化间的相关性,使用半定量RT-PCR方法分析了黄粉虫幼虫、蛹及成虫不同特定发育阶段TmTH在表皮及脂肪体中的表达情况。研究发现TmTH在每个发育阶段的起始表达量较高,且其表达量随着表皮鞣化程度的进行而减少,数据证实TmTH的表达量与黄粉虫表皮鞣化程度密切相关。为进一步研究TmTH蛋白,将TmTH编码区克隆到表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行了IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析显示诱导表达获得大小为62 kD的融合蛋白。这为TmTH体外酶学性质及相关调控等方面的研究提供了便利,体外性质的研究也将是下一步的工作重点。本研究首次在鞘翅目黄粉虫中克隆了酪氨酸羟化酶基因(TmTH)全长cDNA序列并进行了生物信息学分析,研究了该蛋白的体内功能,并在体外成功获得重组蛋白。通过对TmTH在不同发育时期及免疫刺激后的表达特征研究,推测该基因可能与黄粉虫神经活动、表皮鞣化及免疫反应有关,这不仅对研究以黄粉虫为代表的鞘翅目昆虫表皮形成机理具有重要的理论意义,也为研究昆虫病虫害防治提供了一个实践上的参考。