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慢性粒细胞白血病(chronic myelogeous leukemia, CML),是以费城染色体(Philadephia, Ph)和bcr/abl融合基因为特征的多能干细胞异常的骨髓恶性增殖性疾病。bcr/abl基因编码的P210bcr/abl蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性,与CML凋亡缺失、分化抑制、耐药有密切关系。RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默(PTGS)的基因阻断技术,近年来被广泛应用于哺乳动物细胞抑制基因表达。通过RNase III内切酶Dicer的作用产生有活性的小的21-23nt干扰性RNA(short interence RNA, siRNA),介导其互补同源mRNA序列的特异性降解,沉寂目的基因的表达。本研究采用慢病毒介导的RNAi技术,设计合成针对bcr/abl的siRNA,感染人慢性粒细胞白血病K562株,构建bcr/abl长期沉默的细胞模型。利用该细胞模型探讨bcr/abl基因长期沉默对K562细胞生物特性、相关信号分子及姜黄素抗肿瘤作用的影响。一、慢病毒介导bcr/abl基因长期沉默的K562细胞株构建为研究慢病毒介导的K562细胞bcr/abl基因RNA干扰的效率及稳定度,并为后续研究提供细胞模型,我们建立了bcr/abl RNAi稳定转染的B/A-K562模型。研究方法(:1)利用RNAi技术和慢病毒转基因技术,构建pNL-EGFP-U6-bcr/abl-I质粒,使它和pVSV,pHelper组成慢病毒三质粒转染系统,共转染293T细胞,生产EGFP- B/A-I病毒;(2)用EGFP、EGFP-B/A-I病毒分别感染K562细胞,获取混合克隆;(3)极限稀释法、集落形成法挑取稳定表达EGFP、EGFP-B/A-I的克隆;(4)Realtime RT-PCR检测bcr/abl mRNA水平;(5)细胞免疫荧光、Western blotting法检测P210bcr/abl蛋白含量。结果显示:(1)成功包装出具有感染能力的EGFP和EGFP- B/A-I慢病毒;(2)获得稳定表达EGFP和EGFP-B/A-I的EGFP-K562、B/A-K562细胞;(3)体外传代半年后,慢病毒介导RNAi可使bcr/abl mRNA下调63.5 %;(4)P210bcr/abl蛋白含量减少74.5 %。二、Bcr/abl基因长期沉默对K562细胞生物学特性及相关基因表达的影响bcr/abl基因是与CML发生、发展、转归密切相关的癌基因。bcr/abl基因长期“缺席”,可能导致K562细胞各种生物学特性及相关信号分子表达的变化。本部分,我们以bcr/abl基因长期沉默的B/A-K562细胞为模型,与正常对照的K562细胞及空载体对照的EGFP-K562细胞进行比较,分析其主要生物学特性及信号分子的变化。研究方法:(1)锥虫蓝染色法检测细胞增殖能力变化;(2)集落形成法观察RNAi对集落形成能力的影响;(3)联苯胺染色观察细胞分化;(4)流式细胞仪分析细胞周期变化;(5)ELISA法检测酪氨酸激酶活性;(6)AO-EB、Heochst 33342染色观察细胞凋亡;(7)比色法检测Caspase-3、Caspase-9活性;(8)Western blotting法观察RNAi对细胞增殖凋亡相关信号分子的影响。结果显示:(1)bcr/abl RNAi显著抑制K562细胞增殖,细胞倍增时间明显延长;(2)bcr/abl RNAi抑制细胞集落形成,集落形成抑制率达55.05 %;(3)bcr/abl RNAi诱导K562细胞向成熟红系分化,联苯胺染色阳性率达24.83 %;(4)bcr/abl RNAi使细胞周期阻滞在S期,出现凋亡的亚二倍体峰;( 5)bcr/abl RNAi使酪氨酸激酶活性降低约41.88 %;(6)bcr/abl RNAi诱导K562细胞凋亡,自发凋亡率达26.67 %;(7)bcr/abl RNAi触发线粒体Cyt-C释放,Caspase-3及Caspase-9活性提高,从线粒体途径诱导细胞凋亡;(8) bcr/abl RNAi下调K562细胞Src、P-Src、Raf-1、P-Erk1/2、P-Stat 1、P-Stat 5、P-P38、C-myc、Bcl-2和Hsp 90含量,上调P53、PKC及Bax含量,对Erk1/2、P-Akt、NF-КB、Hsp 70影响不大。三、慢病毒介导bcr/abl基因长期沉默对K562细胞裸鼠成瘤的影响及相关机制研究慢病毒介导的RNA干扰,在体外能实现bcr/abl基因的长期沉默,抑制K562细胞增殖,诱导其向成熟红系细胞分化,促进细胞凋亡。本部分我们关注的是:B/A-K562细胞在裸鼠体内能否继续保持对bcr/abl基因的RNA干扰以及成瘤能力和相关信号分子的变化。研究方法:(1)皮下注射K562、EGFP-K562、B/A-K562细胞,建立裸鼠异种移植瘤模型;(2)观察成瘤情况,比较肿瘤体积;(3)称量离体瘤块质量、计算抑瘤率;(4)肿瘤组织测定Caspase-3、Caspase-9活性;(5)肿瘤组织冰冻切片观察荧光;(6)HE染色光镜下观察肿瘤组织的形态结构;(7)免疫组织化学检测肿瘤组织P210bcr/abl、Bcl-2、Bax蛋白表达;(8)免疫印迹检测肿瘤组织中Src、Erk1/2、P-Stat 1、Hsp 90的蛋白含量。结果显示:(1)B/A-K562组肿瘤生长速度明显低于K562组及EGFP-K562组, K562组及EGFP-K562组成廇率100 %,B/A-K562组成瘤率80 %;(2)B/A-K562组抑瘤率达78.4 % (P<0.01);(3)B/A-K562组肿瘤组织Caspase-3、Caspase-9活性显著提高;(4)荧光显微镜观察,慢病毒感染的EGFP-K562及B/A-K562细胞形成的移植瘤均可见绿荧光;(5)免疫组化显示,K562组及EGFP-K562组P210bcr/abl、Bcl-2蛋白呈强阳性表达,Bax蛋白呈弱阳性表达;B/A-K562组P210bcr/abl、Bcl-2蛋白表达明显减弱,Bax蛋白表达明显增强;(6)免疫印迹结果显示,B/A-K562组Erk1/2、Src、P-Stat 1、Hsp 90含量低于K562组及B/A-K562组。四、慢病毒介导K562细胞bcr/abl基因长期沉默对姜黄素抗肿瘤作用的影响及相关机制研究bcr/abl基因及其相关蛋白是Cur作用的重要靶点。本部分,我们用Cur分别处理K562、EGFP-K562及B/A-K562细胞,探讨K562细胞的bcr/abl基因表达被慢病毒介导的RNA干扰阻断后,Cur针对K562细胞的抗肿瘤作用及作用机制有何改变。研究方法:(1)MTT法、锥虫蓝染色法观察Cur对细胞增殖的影响;(2)集落形成法观察Cur对细胞集落形成的影响;(3)联苯胺染色法观察Cur对细胞分化的影响;(4)ELISA法观察Cur对酪氨酸激酶活性影响;(5)流式细胞仪分析Cur对细胞周期的影响;(6)AO-EB染色、DNA琼脂糖凝胶电泳检测Cur对细胞凋亡的影响;(7)分光光度法检测Cur对细胞Caspase-3和Caspase-9活性的影响;(8)Western blotting观察Cur对细胞增殖和凋亡有关信号分子及伴侣蛋白的影响。结果显示:(1)Cur抑制K562、EGFP-K562及B/A-K562细胞增殖,呈时间和剂量依赖关系,Cur作用48小时,IC50分别为6.94、4.93、12.67μg/ml;(2)Cur影响B/A-K562细胞的集落形成,呈量效关系;(3)Cur诱导细胞向成熟红系细胞分化,其促进分化作用被bcr/abl RNAi减弱;(4)Cur降低细胞PTK活性,bcr/abl RNAi可增强其效应;(5)Cur诱导B/A-K562细胞凋亡亚二倍体峰出现,作用呈时间和剂量依赖性;(6)Cur有效诱导B/A-K562细胞凋亡,呈剂量依赖关系;(7)Cur进一步下调B/A-K562细胞P210bcr/abl含量;( 7)Cur促进B/A-K562细胞线粒体细胞色素C释放,活化Caspase-3、Caspase-9,循线粒体途径诱导凋亡;( 8) Cur上调B/A-K562细胞C-fas、P53、P-P38、Bax蛋白含量,下调P-Src、Raf-1、NF-КB、C-myc、PKC、Bcl-2、Hsp 70、Hsp 90蛋白含量。从以上实验结果得出如下结论:1.慢病毒介导的bcr/abl干扰能够实现bcr/abl基因长期沉默,bcr/abl mRNA下调63.5 %,P210bcr/abl下调74.5 %;2. bcr/abl RNAi显著抑制K562细胞增殖,诱导其向成熟红系分化,显著降低PTK活性,循线粒体途径诱导K562细胞自发凋亡;3. bcr/abl RNAi抑制K562细胞增殖,诱导凋亡,作用机制可能与bcr/abl沉默,Src、P-Src、Raf-1、P-Erk1/2、P-Stat 1、P-Stat 5、P-P38、C-myc、Bcl-2、Hsp 90下调,P53、Bax上调有关;4.慢病毒介导的RNAi在裸鼠体内继续沉默bcr/abl基因,显著抑制肿瘤生长,诱导肿瘤组织凋亡和坏死,其抗肿瘤作用机制可能与bcr/abl RNAi及由之引起的Erk1/2、Src、P-Stat 1、Hsp 90、Bcl-2下调,Bax上调有关;5. Cur抑制B/A-K562细胞增殖,诱导分化,降低PTK活性,循线粒体途径诱导凋亡;6. Cur进一步降低B/A-K562细胞P210bcr/abl含量,上调C-fas、P53、P-P38、Bax,下调P-Src、Raf-1、NF-КB、C-myc、PKC、Bcl-2、Hsp 70、Hsp 90,可能与Cur在bcr/abl沉默的背景下,诱导B/A-K562细胞凋亡,抑制增殖有关。总之,慢病毒介导的bcr/abl RNAi能够实现bcr/abl基因的长期沉默,抑制CML细胞增殖,诱导凋亡,作为CML的分子靶向治疗具有潜在应用价值。Cur可在bcr/abl RNAi基础上进一步下调P210bcr/abl,抑制增殖,诱导凋亡,是配合bcr/abl基因靶向治疗理想选择。