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第一部分CD133~+卵巢癌干细胞分离培养及鉴定目的从人卵巢癌A2780细胞中分离得到CD133~+卵巢癌干细胞(Ovarian cancer stem cell,OCSC),并对其球体细胞形成、自我更新以及分化能力进行验证,旨在为靶向CD133~+OCSC的卵巢癌治疗研究奠定基础。方法1、收集A2780细胞,利用别蓝藻素(Allophycocyanin,APC)标记的CD133抗体(APC-CD133)对其进行标记,借助流式细胞术(Flow cytometric assay,FCM)分选得到CD133~+OCSC;2、将CD133~+OCSC接种至无血清培养基进行球体细胞形成实验,观察CD133~+OCSC生物学特性以及形态学变化;3、收集A2780细胞、CD133~+OCSC以及传代培养2w后CD133~+OCSC,采用荧光定量PCR对比三组细胞CD133分子表达情况。结果1、通过FCM对A2780细胞系进行分选,可得到约0.1%的CD133~+OCSC;2、将CD133~+OCSC接种于无血清培养基可发现细胞呈悬浮、球样生长,随培养天数增长球体细胞体积不断增大、数量逐渐增多,且细胞经过传代后可重新形成球体细胞,然而将CD133~+OCSC接种于含血清培养基后则发现其呈贴壁生长;3、荧光定量PCR实验结果显示CD133~+OCSC经过传代培养2w后CD133表达水平降低(P<0.05)。结论卵巢癌A2780细胞系中存在约0.1%的CD133~+OCSC,该细胞具有能形成球体细胞、自我更新以及分化的肿瘤干细胞特性,可作为治疗对象应用于卵巢癌治疗研究。第二部分超声联合Sono Vue转染CD133~+OCSC的参数优化实验目的1、探索不同细胞培养方式、超声参数和转染参数对CD133~+OCSC细胞活力以及基因转染效果的影响;2、优化得到适用于超声联合Sono Vue增强体外转染CD133~+OCSC效率的最佳参数组合,降低超声辐照对细胞损伤的同时提高转染效率。方法1、设置不同细胞培养方式、超声声强及占空比(Duty cycle,DC),采用不同参数组合对CD133~+OCSC进行辐照,然后通过CCK-8实验检测细胞活力比较各参数对细胞活力的影响;2、设置不同转染参数组合体外促进mi R-let-7b转染CD133~+OCSC,采用倒置荧光显微镜观察各参数组合转染后荧光蛋白表达情况,并通过Image J软件对各组荧光表达强度进行半定量分析,比较各参数对基因表达效率的影响。结果1、利用相同超声参数分别对悬浮及贴壁CD133~+OCSC进行辐照,结果发现悬浮细胞经辐照后细胞活力下降较贴壁细胞明显(P<0.05);采用不同声强或DC超声联合Sono Vue辐照CD133~+OCSC,结果发现辐照后细胞活力随超声声强、DC升高而降低;2、采用不同参数组合转染CD133~+OCSC,镜下观察结果以及半定量分析荧光蛋白表达强度结果显示,贴壁细胞较悬浮细胞基因表达效率高(P<0.05),超声声强在0.6W/cm~2~1.0W/cm~2范围内时,基因表达效率随声强增高而增高(P<0.05)。结论不同细胞培养方式、超声及转染参数均可影响细胞活力及基因表达效率,对其优化后产生有效减少细胞损伤并提高转染效率,为保证转染实验细胞活力及转染率,参数优化后确定采用贴壁细胞于DC 10%,声强1.0 W/cm~2超声参数下进行转染实验。第三部分超声联合Sono Vue介导mi R-let-7b抑制CD133~+OCSC生长的研究目的1、设计并构建mi R-let-7b的表达质粒,研究增强mi R-let-7b质粒在CD133~+OCSC中表达是否可抑制其生长;2、探讨UTMD增强mi R-let-7b转染CD133~+OCSC的可行性和应用价值,并比较不同转染方式对转染效率及CD133~+OCSC生长抑制作用的影响。方法对比不同转染方式的转染效率,实验分为6组:(1)空白对照组(C);(2)质粒组(P);(3)超声辐照+质粒组(US+P);(4)Sono Vue+质粒组(MB+P);(5)超声辐照+Sono Vue+质粒组(UTMD+P);(6)脂质体+质粒组(L+P)。转染48h后采用倒置荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光蛋白表达情况,并通过FCM以及CCK-8实验分析各组转染率及细胞活力,最终通过共聚焦显微镜观察转染后细胞凋亡情况。结果1、通过UTMD促进mi R-let-7b质粒在CD133~+OCSC的表达,CD133~+OCSC细胞活力降低、生长受到抑制;2、镜下观察结果显示UTMD+P组EGFP表达水平明显优于P、MB+P及US+P组;FCM检测不同转染方式转染CD133~+OCSC的转染率,结果显示UTMD+P组转染率高于其他各组;CCK-8实验结果显示UTMD+P组细胞存活率(86.42±1.39%)低于P组(93.44±1.84%)、US+P组(88.86±1.57%)以及MB+P(92.46±2.94%);共聚焦显微镜观察转染后细胞凋亡情况显示转染后CD133~+OCSC未见明显凋亡现象。结论UTMD促进体外基因转染可提高mi R-let-7b在CD133~+OCSC的表达水平,并能达到降低CD133~+OCSC存活率、抑制生长的治疗效果。