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在我国原发性肝癌居年死亡肿瘤死因的第二位,肝癌发病隐匿、恶性程度高、发展迅速、治疗困难,一直是我国医学界面临的重大课题。肝癌的发生发展是多基因、多因素参予的复杂过程。从基因水平认识肝细胞的生长、分化、再生和恶变的分子机理,不仅具有重要的研究意义,而且对于肝癌的早期基因诊断和治疗具有重大的临床应用价值。探讨肝癌发生发展和转移的机制对于肝癌的预防、诊断和治疗具有重要的意义。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)又称为分泌磷酸蛋白1(Secreted Phosphoprotein 1,SPP1)、早期T淋巴细胞活性1(Early T-lymphocyte Activation 1,Eta-1)、骨唾液酸蛋白I(Bone Sialoprotein I)和尿石蛋白(Urinary Stone Protein),是一种具有多种功能的分泌性酸性糖蛋白,已归类于细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)蛋白,可促进细胞的粘附和迁移。骨桥蛋白能通过RGD序列与黏附分子如CD44和某些整合素结合,骨桥蛋白有多方面的生物功能。骨桥蛋白的表达和肿瘤的致癌作用密切相关。OPN在很多肿瘤组织中都有异常表达,OPN在乳腺癌、胃癌、肺癌、食管癌、神经胶质瘤、卵巢癌中异常表达,并且同恶性程度和转移相关。OPN可以作为一种判断预后的指标及监测癌肿复发或转移的指标而具临床意义在以往的OPN表达的研究中,大部分的工作采用了免疫组织化学、RT-PCR和Northern Blot方法,只能半定量分析,不能在mRNA水平准确检测表达。应用荧光定量PCR技术可以对OPN的mRNA水平进行实时定量分析,本文同时利用临床肝癌手术标本和大鼠肝癌模型进行骨桥蛋白基因水平表达的检测,并以此探讨骨桥蛋白在肝癌发生发展和转移中的表达变化及其作为早期诊断和潜在的治疗靶点的意义。 <WP=5>第一部分OPN在人原发性肝细胞癌中表达的研究利用肝癌手术标本采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Real-Time Quantitative RT-PCR)检测了OPN编码基因的表达水平。结果显示,骨桥蛋白在原发性肝细胞癌中表达水平明显上升,其中在103例肝细胞癌中的69例中,肿瘤组织中OPN的表达水平高于癌旁肝组织,占67%,其中58例中肿瘤组织的表达水平高于2倍以上,占56%。肝癌组织和癌旁组织的定量检测发现二者有明显差异(0.11(0.28和0.53(0.91,p<0.001),平均倍数为14.58(54.08。进一步研究发现,肝癌组织中OPN表达水平同HBV感染没有明显相关性(HBV+:0.46(0.64,HBV-:0.59(1.07),OPN表达水平在不同的分级的肝癌组织没有明显的差异(I-II/II级:0.41(0.75,II-III级:0.27(0.35,III级:0.56(0.97,III-IV/IV级:0.69(1.115);癌旁肝硬化组织和没有肝硬化的正常或者肝炎肝组织之间也没有明显的OPN表达差异(小结节肝硬化:0.14(0.375;混合结节肝硬化:0.067(0.060;大结节肝硬化:0.069(0.046;正常或肝炎肝组织:0.075(0.075);OPN表达水平在包膜侵犯阳性的肝癌组织中不但不高于反而低于包膜侵犯阴性的肝癌组织,但二者没有明显差异(包膜侵犯+:0.509(0.756,包膜侵犯-:0.569(1.179,p=0.358);相似的,在癌栓阳性的肝癌组织中OPN表达水平也略低于癌栓阴性的肝癌组织,但是也没有明显的差异(癌栓+:0.408(0.448;癌栓-:0.581(1.049,p=0.123);在子灶阳性的肝癌组织中OPN表达水平也略低于子灶阴性的肝癌组织,但是也没有明显的差异(子灶+:0.408(0.448;癌栓-:0.581(1.049,p=0.415)。虽然这些同转移相关的指标和肝癌组织中OPN表达水平之间没有明显的关系,但是OPN表达水平同肝癌的大小相关,小于5cm的肝癌组织中OPN表达水平(0.262(0.529)明显低于大于5cm的肝癌(0.602(0.988),p=0.021。肝癌组织中OPN表达水平同甲胎蛋白水平也没有明显关系(AFP<20:0.436( 1.099,AFP<20:0.585(0.780,p=0.46)。采用肝脏细针穿刺获得肝组织活检标本进行了肝硬化组织和非肝硬化的正常或者肝炎肝组织中OPN表达检测,发现没有明显的差异(肝硬化:0.054( 0.074,非肝硬化:0.047(0.031,p=0.70)。结果提示,OPN是一个重要的肝癌相关基因,在肝细胞癌中表达明显增强,并且同肿瘤大小相关。OPN在肝硬化中的表达相对于正常或者肝炎肝组织而言<WP=6>没有明显的变化。OPN在肝癌的发生和发展中可能起重要作用,并且具有用作肝癌诊断和预后判断的潜在价值。我们同时发现,OPN的表达同一些肝癌转移相关指标之间没有明显的相关性,提示OPN表达水平同肿瘤灶的转移潜力的关系和作为肝癌转移相关基因有待于进一步研究。第二部分OPN在大鼠肝细胞癌发生发展过程中表达的研究为了验证OPN基因同肝癌的关系并且深入探讨OPN基因在肝癌的发生发展过程中的动态变化,制备了化学药物二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DENA)诱导的大鼠肝癌模型并同样以实时荧光定量RT-PCR准确检测了OPN基因表达水平。结果显示,大鼠原发性肝癌模型模拟了从肝脏化学性炎性损害、肝硬化、肝癌早期到晚期的各个阶段。大鼠OPN同源基因在正常大鼠正常肝脏中表达较低,在大鼠肝癌组织中OPN表达急剧升高,随着肝癌的进展表达逐渐上升,在整个肝癌的发生发展过程中OPN的表达是逐渐升高的。大鼠肝癌模型的组织芯片的免疫组化检测同样证实了上述结果,采用组织芯片方法制备了肝癌组织微阵列并以此进行OPN表达的蛋白水平研究,结果证实了定量PCR的结果,发现在肿瘤组织中免疫组织化学染色位?