论文部分内容阅读
背景：血吸虫病(schistosomiasis)给公共卫生及农牧业造成了极大的危害。日本血吸虫(Schistosoma japonicum, S. japonicum)每条雌虫平均每天产卵约2,200个,大多数虫卵沉积在宿主的肝脏和结肠肠壁等组织中,成熟虫卵中的毛蚴释放可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen, SEA)引发宿主的免疫病理反应,从而形成虫卵肉芽肿(egg granuloma)及导致组织纤维化,部分虫卵随宿主粪便排出体外,入水后可孵育出毛蚴感染中间宿主钉螺,成为血吸虫病传播的起始。因此,虫卵在血吸虫的致病及传播中起了重要的作用。从理论上讲,抑制血吸虫雌虫产卵或阻止虫卵成熟将有助于防控血吸虫病。目前尚无有效的血吸虫疫苗,防治血吸虫病主要依赖化学药物吡喹酮,但药物本身有一定的副作用,并且长期使用有可能产生耐药性,研究新的血吸虫病防制手段极为迫切。酚氧化酶(phenol oxidase,PO)在日本血吸虫虫卵卵壳形成过程中起着非常重要的作用。PO是一种铜离子结合的氧化酶,能催化两个不同的酶学反应：1)单酚氧化酶(MPO, monophenol oxidase, E.C.1.14.18.1)将单羟基酚(monophenol)氧化为双羟基酚(diphenol);2)双酚氧化酶(DPO, diphenol oxidase, E.C.1.10.3.1)将双羟基酚再进一步氧化为醌(quinones)。血吸虫的基因编码两种形式的PO。Ftitzpatrick等(2007)报道了曼氏血吸虫两个PO的分子特性；蔡国斌等(2009)报道了日本血吸虫两个PO (SjPO1和SjP02)的分子特征和表达。但SjPO1和SjPO2的基因组结构之前未见报道,而且尚不清楚是否还存在其它形式的PO,以及是否SjPO1和SjPO2均在日本血吸虫虫卵卵壳的形成过程中起作用。目的：本课题的开展基于如下假设：由于SjPO1和SjPO2的mRNA序列已经公布,并且二者的同源性较高(有38%的氨基酸序列相同),因此推测它们具有相同的功能,都参与日本血吸虫虫卵卵壳的硬化过程。有必要深入了解SjPO1和SjPO2的分子特性、在日本血吸虫不同发育阶段的表达及组织定位,以及能否诱导抗血吸虫生殖,并在基因水平揭示SjPO的功能,尤其在虫卵卵壳硬化过程中的作用机制。方法：根据SjPO1和SjPO2的mRMA序列,用PCR扩增SjPO1和SjPO2的基因组序列、测序并进行结构分析；用半定量RT-PCR检测这两个基因在日本血吸虫的不同发育阶段的转录水平；用免疫组化和原位杂交技术对SjPO1和SjPO2在日本血吸虫成虫及肝脏内虫卵中的分布进行定位；制备SjPO1重组蛋白并免疫小鼠观察能否诱导小鼠的减虫或减卵作用；用小干扰RNA (siRNA)介导SjPO1和SjPO2基因的敲减,比较敲减其中一个与同时敲减两个基因的干扰效果；用重组慢病毒载体(lentiviral vector, LV vector)转导外源基因到日本血吸虫体内,产生siRNA干扰SjPO1基因的表达,检测其对PO活性的抑制效果；通过评估基因转录水平和酶蛋白水平的改变比较这两种干扰方法的沉默效率。结果：SjPO1和SjPO2在系统进化上可能源自共同的祖先基因,它们的基因组结构均由3个外显子和2个内含子组成；SjPO1和SjPO2在尾蚴阶段均未见有转录,随着在终宿主体内的发育其转录水平逐渐增加,它们在雌性成虫的转录水平高于雄性成虫的,SjPO1基因的表达水平高于SjPO2基因的；SjPO1和SjPO2基因均在雌性成虫的卵黄腺、雄性成虫的体表及虫卵内的毛蚴有表达；SjPO1重组蛋白免疫小鼠不能诱导减虫作用,但有一定的减卵作用,减卵率为21.67%；敲减SjPO1和SjPO2基因的表达后PO的活性均有显著下降,并且虫卵卵壳的形态出现异常改变,包括梭形卵、卵壳凹陷以及相互粘连,当DPO活性下降约超过45%时,卵壳的自发荧光明显减弱,而同时雌虫子宫内出现荧光；同时敲减两个SjPO基因的抑制效果较敲减一个的明显；慢病毒载体介导的干扰效果优于siRNA所介导的。结论：SjPO1和SjPO2均在日本血吸虫虫卵卵壳硬化的过程中起重要作用,但以SjPO1为主。研究结果从基因水平进一步揭示了SjPO的功能,也为抗血吸虫雌虫生殖的深入研究提供了理论参考。