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丙酮、丁醇发酵曾是仅次于酒精发酵的世界第二大发酵工业,由于石化工业的飞速发展,丙酮、丁醇发酵逐渐衰退。随着石化资源的耗竭和温室效应等环境问题的日益突出,丙酮、丁醇发酵重新显示出竞争优势,逐渐成为解决能源危机的重要方法之一。
本论文采用离子注入进行诱变,通过自行设计的筛选方法筛选丙酮、丁醇发酵高产突变菌株,并对发酵条件进行了初步优化。
首先建立了丙酮、丁醇发酵高产菌的快速筛选方法。以2-脱氧-D-葡萄糖作为抗代谢阻遏物,筛选高淀粉酶活性的突变株,再根据丙酮、丁醇发酵代谢途径中先产酸后产溶剂以及高活力厌氧发酵细胞具有较强还原力的特点,设计了溴甲酚绿和刃天青两种筛选平板,筛选高产酸和高还原能力的突变株,进而得到丙酮、丁醇发酵高产菌。该方法操作简单,筛选效率高。
选用离子注入诱变技术进行丙酮、丁醇发酵高产菌的选育,通过自行设计的筛选方法筛选得到了一株高产突变菌株I4-28,其总溶剂和丁醇产量分别达到15.24 g/L和10.62 g/L,比出发菌分别提高了26.28%和43.31%,丁醇比例由出发菌的63.39%提高到71.94%。经过8次连续传代,I4-28突变株具有较好的传代稳定性。对I4-28突变株在3 L发酵罐中的丙酮、丁醇发酵进行了初步研究,其总溶剂产量高于摇瓶发酵,达到19.00 g/L,丁醇比例达到70.37%。
研究表明,海藻糖可以提高菌体对丁醇的耐受性和溶剂产量,这对今后引入海藻糖合成的相关基因来提高菌体的丁醇耐受性有重要的指导意义。
针对厌氧菌的特点,开发出一种简单、快速、准确的确定种子液最佳接种时间的方法--菌体还原活力法。选用刃天青作为指示剂,以菌体使刃天青褪色时间作为指标,来衡量菌体的活力,进而确定种子液的最佳发酵时间。研究表明种子液的还原活力和总溶剂的产量成近似的正比例关系,I4-28突变株的种子液在12 h时还原活力达到最大值1.00 min-1,总溶剂产量同时也达到最大值。
对高产突变菌株I4-28的产溶剂发酵进行了条件优化。优化后的摇瓶发酵条件:菌种100℃热激1 min,种子液接种时间为12 h,接种量为7.5%,玉米粉浓度为60 g/L,糊化时间为1.5 h,发酵12 h添加2.0 gm乙酸和3.0 gm丁酸;优化后的总溶剂和丁醇产量分别达到18.13 g/L和13.26 g/L,比优化前分别提高20.55%和22.55%,丁醇比例达到73.14%。